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【摘要】 目的 探讨肾综合征出血热(HFRS)的发病机理。方法 2～3天的近交系Balb/C乳鼠，脑内接种早期HFRS重症患者软腭粘膜出血点组织悬液，用套式聚合酶链式反应检测乳鼠脑、肺及肾组织中的HFRS病毒RNA。结果 接种乳鼠发病死亡，剖检显示，发病乳鼠各器官呈现明显微血管系统和实质组织病变，乳鼠脑、肺及肾组织中HFRS病毒RNA阳性。结论 早期HFRS患者软腭粘膜出血点组织中含有HFRS病毒。
The pathogenicity of HFRS patient′s soft palate mucosa to suckling mice ZHANG Lin, ZHANG Lu, WANG Suqin. The First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To expiore the pathogenic mechanism of hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS).Methods 2-3 days old inbred Balb/C suckling mice were inoculated intracerebrally with tissue suspension of soft parate petechia of HFRS patients and the HFRS virus RNA was tested in brain, lung and kidney tissues of sucking mice by nested PCR.Results Some of the mice developed acute disease and died. The autopsy analysis indicated that these mice showed pathological changes in system microvascular and parenchymatous tissues. HFRS virus RNA was detected in their brains, lungs and kidney tissues.Conclusions These results indicate that HFRS virus exists in the tissue of petechial hemorrlngic spots on soft palate petechia of HFRS patients.
【Key words】 Suckling mouse Hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) Soft palate Petechia Polymerase chain reaction
肾综合征出血热(HFRS)是一种由肾综合征出血的热病毒(HFRSV)引起的以几种鼠类为宿主的严重传染病［1］。我们曾报道了一组经血清学证实的HFRS患者，在临床上软腭粘膜均有大小不等的出血点并以此作为临床早期诊断的指标［2，3］。应用电镜技术在数例患者软腭粘膜组织中找到了病毒颗粒，胶体金检测亦呈现阳性结果［4，5］。此发现首次证实了口腔软腭磷状上皮细胞属HFRSV侵袭的靶细胞。1982年Tsai等报道经乳鼠脑内接种HFRSV可致其发病死亡，这种乳鼠模型沿用到今［6］。常规的乳鼠模型都是用HFRS病毒株使其致病，直接用出血热患者软腭粘膜组织制成悬液对乳鼠作脑内注射，目前尚未见报道。为了进一步探讨肾综合征出血热患者口腔软腭出血的发病机理及确证HFRSV的新定位，我们采取HFRS患者软腭出血点组织对乳鼠直接进行脑内接种，观察其对乳鼠的致病性。
1 材料和方法
1.1 组织取材 临床上确诊为HFRS的早期住院患者。临床分型：重型1例，中型2例(按1986年南京EHF学术会议标准)。患者的软腭均有独特的出血点于出血点处常规消毒，持活检钳夹取大小约1 mm×1 mm×1 mm粘膜组织数块，置于200目钢网上研磨。加入常规量青霉素，10%小牛血清，Eagle氏液(pH7.4)，混匀制成10%悬液，2 000～3 000 r/min离心15～20 min，取上清，液氮存放待检。取材局部粘膜用10%硝酸银烧灼止血，生理盐水涂洗2～3遍，观察片刻无出血倾向即可。
1.2 实验动物及分组 2～3天体重为1.55～1.65 g的 Balb/C乳鼠50只(河南医科大学动物实验中心提供)。分为5组，每组10只，第1组乳鼠脑内注射0.02 ml生理盐水；第2组乳鼠脑内接种0.02 ml重型HFRS患者软腭粘膜组织悬液；第3、4组乳鼠脑内接种0.02 ml中型HFRS患者软腭粘膜组织悬液；第5组乳鼠脑内直接注射0.02 ml A16株HFRS病毒悬液；实验组及对照组乳鼠均由母鼠喂养，逐日观察发病情况。
1.3 RNA的提取 实验组及对照组乳鼠的脑、肺及肾组织各30 mg，PBS缓冲液冲洗后加入1 mlGIT缓冲液进行匀浆。用蛋白酶K-SDS液消化(蛋白酶K， 100 μg/ml;SDS, 0.5%)37℃温育30分钟。采用酚-氯仿法提取RNA［7］。
1.4 套式聚合酶链式反应(Nested-PCR) Nested-PCR试剂盒购于第四军医大学基因诊断技术应用研究所。第1对引物：(1)5′-GAGATGATCATCAGGTTCAA-3′，(2)5′-GTGATAACATGGATCCTGAG-3′；第2对引物：(1)5′-TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT-3′，(2)5′-AAGCTTTAGTAGTAGACTCC-3′。利用该引物对可特异性地扩增出位于HFRSV高度保守区序列的430 bp的基因条带。第1次扩增：反应体系为50 μl, 其中含有20 mmol/L RNA抽提液，0.5 μmol/L第1对引物，40 U的RNase,5.6 U鸟成骨髓瘤病毒逆转录酶，10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),1.5 mmol/L MgCl2,0.01%明胶，200 μmol/L dNTP;反应程序：94℃热启动60 s，随后94℃变性35 s，55℃退炎45 s，72℃延伸50 s，循环36次，最后一次循环的延伸时间为200 s。第2次扩增：含5 μl第1次PCR产物，0.5 μmol/L第2对引物，其他条件同第一次。反应结束后取10 μl扩增产物进行2.0%的琼脂糖凝胶电泳(5-7V/cm，20 min)。在紫外灯下观察结果，根据DNA分子量标准鉴定扩增产物的大小。
2 结果
2.1 感染乳鼠的临床表现及发病情况分析 乳鼠多在接种后6～9天发病：背部弓起，行动迟缓，体重不增或增长迟缓，精神萎靡，卷缩和昏迷。继而两侧后肢僵直，终至死亡。剖检乳鼠可见其胸腔内有少量积液，两肺充血或见斑块状出血灶，肝、肾及脑膜血管充血，各脏器之间有轻度粘连。第1组注射重型HFRS患者软腭粘膜组织悬液的乳鼠及第5组阳性对照组全部发病死亡。另外两组注射中型HFRS患者软腭粘膜组织悬液的乳鼠及阴性对照组未见异常。结果表明HFRS患者口腔软腭粘膜出血点组织对乳鼠具有一定程度的致病性。
2.2 套式-PCR对发病乳鼠脏器组织的检测分析 实验组及对照组各脏器组织的PCR检测结果，从第2组注射重型HFRS患者软腭粘膜组织悬液乳鼠的脑、肺、肾组织及第5组阳性对照肾组织中均扩增出大小为430 bp的目的基因条带，而阴性对照组及注射中型HFRS患者软腭粘膜组织悬液的乳鼠脏器组织呈现阴性结果。见图1。
3 讨论
业已知道，HFRS病毒在机体内的靶细胞具有显著的广泛性。我们经过多年的临床实践与基础研究发现：HFRS患者软腭粘膜出血点阳性率为100%，并在3例重型HFRS患者软腭出血点处找到了病毒颗粒，从而证实口腔软腭磷状上皮细胞属EHF侵袭的靶细胞［4］。
HFRS病毒作脑内接种，对乳鼠具有高度的致病性［6］。本实验采用1例重型，2例中型HFRS患者软腭粘膜组织悬液对乳鼠作脑内注射，结果重型组乳鼠全部发病死亡，并且剖检显示各器官呈现明显微血管系统和实质组织的病变，进一步用套式PCR对乳鼠脑、肺及肾组织悬液进行了检测，扩增出目的基因条带，从而再一次证实了口腔软腭粘膜鳞状上皮细胞是HFRS病毒侵袭的靶细胞，为王素琴等［3］关于HFRS临床早期诊断指标的观点提供了进一步的依据；中型HFRS患者软腭粘膜组织悬液对乳鼠没有致病性，套式PCR检测亦示阴性结果，该现象的作用机制尚不清楚，目前正在探索中。