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脐血单个核细胞表达IL-12、IFN-γ及其mRNA的观察
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 细胞因子
作者：蒋利萍 杨锡强 李成荣 吴仕孝 王莉佳
单位：400014 重庆医科大学儿童医院
白细胞介素12(IL-12)的主要作用是促进TH1细胞和自然杀伤细胞(NK)产生γ-干扰素(IFN-γ)，介导细胞免疫。脐血单个核细胞(CBMC）产生 IL-12的能力鲜见报道。重组 IL-12（rIL-12）在体外能促进新生儿CD4+T细胞产生IFN-γ 〔1〕。本文用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测8例CBMC体外表达IL-12p40 mRNA和IFN-γ mRNA的能力；用ELISA法测定8例CBMC培养上清液IFN-γ水平，并观察 rIL-12对CBMC IFN-γ及其mRNA表达的影响。
材料与方法
1.标本：8例足月顺产儿脐血标本，男4例，女4例；平均胎龄38周，平均产重3.4kg。10例健康成人标本，男5例，女5例，平均年龄32岁。采血前4周无血制品及免疫调节剂应用史。
2.分离培养细胞：按常规操作无菌分离外周血或脐血单个核细胞（PBMC和CBMC），用RPMI 1640(含10％小牛血清）调细胞终浓度至106/ ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养细胞。制备细胞培养上清液用2×106细胞，培养48小时；提取细胞总RNA用4×106细胞，培养12小时；细胞培养上清用以测定IFN-γ。
3.IFN-γ测定：
(1)用“IFN-γ ELISA检测试剂盒”（第二军医大学）测细胞培养上清液中IFN-γ浓度，标本不稀释加刺激剂PMA+抗CD3，PMA+抗CD3+rIL-12及对照(不加刺激剂)。
(2)用TRIzolTM试剂盒提取培养细胞总RNA；采用Sandhya等方法合成互补DNA（cDNA）〔2〕；以IL-12p40、IFN-γ各自特异性寡核苷酸引物在DNA扩增仪（PCR仪，PE2400型）中扩增各自cDNA，经电泳、照相记录结果，图象扫描测IL-12p40 mRNA，IFN-γ mRNA表达情况。
结果与讨论
细胞培养上清液中IFN-γ浓度：表1显示，受乙酰肉豆蔻佛波脂(PMA)＋抗CD3刺激后，CBMC体外产生IFN-γ浓度较成人显著低下，经rIL-12协同PMA＋抗CD3刺激，CBMC体外产生IFN-γ浓度可达到成人水平。
表1 细胞培养上清液IFN-γ浓度(ng/ml,
标本
例数
对照
PMA+抗CD3
PMA+抗CD3+rIL-12
CBMC
8
2.74±0.04
2.94±0.17
3.50±0.54
PBMC
10
2.73±0.03
3.34±0.46
3.52±0.66
IL-12p40 mRNA，IFN-γ mRNA表达：RT-PCR结果显示，CBMC受脂多糖（LPS）刺激或PMA＋抗CD3刺激后体外表达的IL-12p40 mRNA较成人显著低下；受PMA＋抗CD3刺激后，CBMC体外表达IFN-γ mRNA较成人显著低下，单加rIL-12至培养系统，可使CBMC表达IFN-γ mRNA部份增高，但未能使CBMC表达IFN-γ mRNA达到成人水平。
IL-12是由p40，p35两条多肽链组成的异二聚体，其中p35可由多种细胞产生，p40则由产生 IL-12的细胞产生，故测IL-12p40 mRNA可反映IL-12基因表达状况。IFN-γ能抑制病毒复制，保护正常细胞免受病毒损害，并激活巨噬细胞促进多种免疫细胞成熟，在机体抗病毒、抗肿瘤和免疫调节中发挥重要作用〔3〕。对新生儿IFN-γ水平低下的原因，以往多数学者认为与巨噬细胞功能不完善，调节功能紊乱，T细胞内源性缺陷及NK细胞缺陷有关。随着分子免疫学研究的发展和对IFN-γ基因表达调节因素研究的深入，新近发现 IL-12是TH1细胞和NK细胞产生IFN-γ的强烈诱导剂〔4〕。本文结果显示，rIL-12能明显纠正CBMC产生IFN-γ及其mRNA表达的不足，尤其在有PMA和抗CD3协同作用时，rIL-12促进IFN-γ产生的作用比无协同剂作用时更强。此结果证实了IL-12可促进由丝裂原激活的T细胞和NK细胞诱导IFN-γ产生的理论。rIL-12对新生儿严重、慢性细胞内病毒感染可能有治疗作用〔5〕。 本课题受卫生部科研基金资助(编号：94-1-354)
参考文献
[1]Wu CY,Demeure C,Kiniwa M,et al.IL-12 induces the production of IFN-γ by neonatal human CD4 T cells.J Immunol,1993,151∶1938-1949.
[2]Sandhya LD,Lagoo AS,Barber WH,et al.A standardized approach to PCR-based semiquantitation of multiple cytokine gene transcripts from small cell samples.Lymphokine Cytokine Res,1993,12(2)∶59-67.
[3]向近敏，林雨霖，赵利淦.关于干扰素的分子生态学.免疫学杂志，1993，9(2)∶71-75.
[4]D'Andrea A,Rengaraju M,Valiante NM,et al.Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12)by peripheral blood mononuclear cells.J Exp Med,1992,176∶1387-1398.
[5]Trinchieri G,Scott P.The role of interleukin 12 in the immune response,disease and therapy. Immunology Today, 1994, 15(10)∶460-463.
(收稿：1997-11-04 修回：1998-10-09)