5-氟尿嘧啶诱导人淋巴细胞免疫耐受的作用观察

5-氟尿嘧啶诱导人淋巴细胞免疫耐受的作用观察

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 基础免疫学

作者：葛建军　内田孝之　张启伟　吉川正博　胡永校　谷春久　富田幸裕　安井久乔

单位：葛建军　胡永校 　谷春久（110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院心胸外科）；内田孝之　张启伟　富田幸裕　吉川正博　安井久乔（日本九州大学医学部）

　　药物诱导免疫耐受中，用环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)诱导最具代表性，它是一种选择性杀伤增殖细胞DNA的抗细胞有丝分裂药物。将供体小鼠的脾细胞(10⁸)注射到受体小鼠体内，2天后将200mg/kg的CP注射给受体小鼠，就可以成功地诱导出H-2不相容小鼠的特异性免疫耐受^〔1〕,有人将这一模式称为细胞→CP模式（cells-followed-by-CP system）^〔2〕。许多实验已经证实环磷酰胺能诱导出小鼠对同种移植物（心脏、皮肤）的特异性免疫耐受，但由于人类脏器移植的局限性，这种方法只停留在基础研究阶段而未应用于临床研究。已经有人在体外以同样的原理诱导出小鼠脾细胞的特异性无应答^〔3〕，由于CP在体外的作用性极小，而5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）在体外对增殖细胞有抑制作用,故本实验用5-Fu以同样的方法对人外周淋巴细胞进行免疫无应答的诱导，现报道如下。

　　材料与方法

　　参照文献〔3〕采取人外周全血，用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞（PBL），将受体细胞（血型A）作为应答细胞(2.5×10⁵/0.1ml)，供体细胞（血型B）作为刺激细胞（5×10⁵/0.1ml)进行混合淋巴细胞培养（MLR），选用增殖强烈的PBL作为供体。受体细胞3×10⁷个(应答细胞responder)与经3000rad ⁶⁰　Co照射后的供体1细胞1.5×10⁷个(刺激细胞stimulator)放入含有5ml RPMI 1640培养液(含10%小牛血清，100U/ml的青霉素和链霉素等)的平底培养皿中，在含5%　CO₂,37℃的培养箱中培养2天，再加入7.5μg/ml的5-Fu，对照组加入同量的培养液，作用9小时，清洗3次(2000r/min×5min)。细胞计数后作为应答细胞及效应细胞(effector)分别与供体1、供体2细胞(作为刺激细胞及靶细胞)进行4天的混合淋巴细胞培养（MLR）及4小时⁵¹Cr释放试验（CTL），以检验经5-Fu处理的细胞对供体1、供体2细胞再刺激时的增殖程度及对供体1、供体2靶细胞的杀伤活性。

　　结果与讨论

　　在受到供体1细胞刺激2天，又被5-Fu作用9小时后，混合淋巴细胞培养实验中针对供体1细胞的再刺激产生了无应答；对供体2细胞的再刺激则有明显的增殖反应,两者相比差异有显著性(P＜0.01)；而未用5-Fu组则有强烈的增殖反应，说明这种无应答状态的产生与5-Fu作用有关系。另外，这种“耐受细胞”只对供体1细胞不产生杀伤活性，与对供体2细胞的杀伤活性相比差异有显著性(P＜0.01)；未用5-Fu组则有较强的杀伤活性。产生无应答状态的细胞只见于5-Fu组中，说明这种无应答状态的产生与5-Fu作用有直接关系（见表1）。

表1　预致敏2天供体1细胞的特异性抑制作用

　　*与对照组相比 P＜0.01　　对同种移植抗原进行免疫耐受诱导的方法很多，包括新生儿免疫耐受诱导,放射线照射免疫耐受诱导,抗体诱导免疫耐受，及药物诱导免疫耐受等。药物诱导免疫耐受一直被人们重视，用环磷酰胺(CP)能诱导出小鼠明确的免疫耐受^〔1〕，目前尚无用药物诱导人免疫耐受的报道，本实验利用CP诱导免疫耐受的方法，在离体实验中对人淋巴细胞进行了免疫耐受诱导。经5-Fu处理的“耐受细胞”在MLR及CTL中均出现特异性免疫无应答现象(针对供体1细胞，表1)。这种细胞→CP模式（cells-followed-by-CP system）诱导免疫耐受的机制目前尚无确切定论，一般认为主要是：（1）克隆破坏(clonal destruction),（2）克隆缺失(clonal deletion)，（3）克隆无反应性(clonal anergy)，（4）抑制性T细胞存在(suppressor T cells)^〔2〕。CP（5-Fu）是一抗细胞有丝分裂药物，对分裂活跃的细胞杀伤性强烈，当受体T淋巴前驱细胞在受到外来抗原的刺激后大量增殖，而正是在此增殖过程中加入CP（5-Fu），导致这些针对该抗原而活化的成熟T细胞特异性地破坏，从而造成受体对该抗原再刺激时的特异性无应答。目前，环磷酰胺诱导免疫耐受的方法已经基本成熟，有人正准备进行大动物的免疫耐受诱导。

　　参考文献

　　[1]Hisanori Mayumi, Kunisuke Himeno,Kazuo Tanaka,et al.Drug-induced tolerance to allografts in mice.9.Establishment of complete chimerism by allogeneic spleen cell transplantantion from donor made tolerance to H-2-indentical recipients. Transplantation.1986，42∶417-422.

　　[2]Mayumi H, Umesue M, Nomoto K.Cyclophsphamide-induced tolerance: an overview. Immunobiology,1996，195(2)∶129-139.

　　[3]Noriaki Tokuda,Hisashi Gondo,Hisanori Mayumi,et al.Drug-induced in vitro tolerance to allogeneic antigens. I.Establishment of a tolerance induction system in a full allogeneic murine combination. Transplantation.1986，42∶281-287.

(收稿：1998-01-04　　修回：1998-06-20)