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通用引物检测脑炎患者脑脊液疱疹病毒DNA及其酶切鉴
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 免疫检测
作者：定左丽 胡芸 郭辉玉
单位：左丽（550004，贵阳医学院免疫学教研室）；胡芸（贵州黔南州医院）；郭辉玉（广州中山医科大学微生物学教研室）
疱疹病毒(HSV)引起的脑炎不经治疗死亡率高达70%， 若获早期诊断治疗， 死亡率可降至(19～28)%〔1〕。临床迫切需要快速、特异、敏感的诊断方法。90年代后， 陆续有用PCR对病毒性脑炎作病原诊断的报道，但用通用引物检测病人脑脊液（CSF）中疱疹病毒DNA的报道并不多见。我们选择疱疹病毒科病毒DNA多聚酶基因高保守区一对引物，对中枢神经系统(CNS)感染病人CSF作PCR扩增和病毒分离，以研究病毒性脑炎的快速诊断方法。
材料与方法
1.标本：80例病人的80份CSF由贵州省黔南州医院等单位提供。其中A组30例，均为出生1年内婴儿；B组25例，2～83岁；C组25例，1～76岁。A、B两组参照文献〔2，3〕临床诊断为“散发性脑炎”；C组为疑为CNS感染病人。采集发病2～30天CSF，-30℃保存备用。
2.主要试剂：Taq DNA聚合酶、dNTP、蛋白酶K、 SmaI 限制性内切酶、 琼脂糖、DMEM等购于华美生物工程有限公司。余为分析纯试剂。
3.毒株和菌株：HSV-1（F株）、HSV-2（G株）、CMV（AD169）、EBV（B95-8），结核杆菌和脑膜炎双球菌均由本室保存。
4.细胞：Hep-2、Vero、HEL由本室保存。
5.引物：参考文献〔5〕发表序列，扩增靶序列位于疱疹病毒科病毒DNA多聚酶基因区。
上游引物序列：5'-CGACTTTGCCAGCCTGTACC-3'； 下游引物序列：5'-AGTCCGTGTCCCCGTAGATG-3'。
扩增片段HSV为518bp；EBV为524bp；CMV为589bp。委托中山医科大学遗传室合成。
6.病毒分离：将待测CSF作10-1、10-2和10-3稀释后接种Hep-2、Vero和HEL单层细胞， 每稀释度3瓶，设HSV-1、CMV和不加病毒对照；以HSV-1在48～72小时内出现明显细胞病变（CPE）；CMV接种HEL在15天内出现CPE；正常细胞无自然蜕变；待测标本不出现CPE，冻融3次后盲传2代，仍不出现CPE视为阴性。
7.病毒DNA提取：400μl CSF加等量裂解液（0.2mol/L Tris-HCl pH7.5；25mmol/L EDTA；0.3mol/L NaCl；2%SDS和蛋白酶K）混匀后56℃水浴1～2小时； 常规配制酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）；DNA沉淀溶于20μl三蒸水，-30℃短期保存备用。
8.PCR扩增：反应体积50μl。常规加入各种试剂，引物和模板，三蒸水补足量。混匀后94℃变性7分钟，72℃加入Taq DNA聚合酶1.5U，石蜡油封顶； 电热恒温水槽手工进行PCR，循环：92℃ 60秒，58℃ 60秒，72℃ 90秒，循环30次，末次72℃ 7分钟。每次实验设阳性及阴性对照。
9.PCR产物检测：取10μl PCR产物置1.5%琼脂糖凝胶（含溴乙锭0.5μg/ml）电泳，电流40mA，电压5V/cm，电泳缓冲液0.5×TBE，40分钟。紫外透射仪观察结果。 设DNA分子量标准对照。
10.PCR产物酶切鉴定：取PCR产物10μl置于0.5ml eppendorf管，加2μl 10×酶切缓冲液，SmaⅠ10U，三蒸水补至20μl，37℃ 2小时。观察结果同上。
结 果
1.病毒分离：80份CSF均未分离到病毒。
2.患者主要临床资料和PCR结果：A、B两组病人CSF分别有22和18份检出疱疹病毒DNA，C组无阳性。
3.PCR敏感性和特异性：提取HSV-1 DNA，紫外分光光度计定量后作不同稀释，PCR扩增，可检出10fg HSV-1 DNA。仅有疱疹病毒科4种病毒DNA有特异性扩增， 分子量大小与理论值相等。余病原体均为阴性。
4.PCR产物酶切鉴定：用SmaⅠ对HSV-1、-2、CMV、EBV和病人CSF阳性PCR产物作酶切分析。可将HSV-1切为476bp和42bp两个片段；将EBV切为424bp和100bp两个片段；CMV和HSV-2不被酶切。
5.病人CSF PCR检测结果：从表1可见，“散发性脑炎”患者CSF疱疹病毒DNA检出率为72.73%；A、B两组检出率差异无显著性（P＞0.05）；但两组不同型别HSV 检出率差异有显著性（P＜0.001）。1岁以上CNS感染患者（B+C组）疱疹病毒DNA检出率为36%（18/50）。
表1 两组病人脑脊液中HSV DNA检出情况
| A组 | B组 | |||
| 阳性数 | (%) | 阳性数 | (%) | |
| HSV1 | 2 | (6.67) | 15 | (60.0) |
| HSV2 | 20 | (66.66) | 2 | (8.0) |
| CMV | 0 | (0) | 1 | (4.0) |
| EBV | 0 | (0) | 0 | (0) |
| 总数 | 22 | (73.33) | 18 | (72.0) |
注：A组30份样品，B组25份样品
讨 论
本研究表明，贵州省临床诊断为“散发性脑炎”的患者中，疱疹病毒感染占有较大比例（40/55）；而1岁以上CNS感染患者（B+C组）疱疹病毒DNA阳性率为 36% （18/50）。1岁内患儿HSV-2感染率较高（19/22）；1月内新生儿HSV-2感染占100%（11/11）；B组2例HSV-2感染者也仅2～3岁，究其原因可能与出生时经过被HSV-2感染的产道有关。B组HSV-1感染较常见，1例CMV感染者已76岁，并在发病前5 月因肺癌接受化疗，证明免疫力低下者易发生CMV感染。80份患者CSF均未分离到病毒，证实病毒分离敏感性差。而利用PCR技术，可在发病第2天病人CSF中检出疱疹病毒DNA。我们用一对引物一次PCR扩增可同时检测4种病毒。
本课题受贵州省教委基金资助
参考文献
[1]Koenig HS，Rabinowitz ED, Miller V. Post infectious encephalomyelitis after successful treatment of herpes simplex enceplalitis with adenine arabinoside. U1trastructural observations. N Eng1 J Med, 1979,300∶1089-1093.
[2]沈伯均，傅曾矩，主编.最新儿科诊疗手册.天津：天津科学出版社，1995,386-387.
[3]李德香，徐玉祥，陈玉芳,等主编.简明神经科学. 北京：人民卫生出版社，1996,288-295.
[4]Kouzarider T,Bankier AT, Satchwell SC, et al. Sequence and transcription analysis of the human cytomegalovirus DNA polymerase gene.J Virol, 1987,61∶125-133.
（收稿：1997-09-12 修回：1998-07-29）