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腮腺炎病毒疫苗株与野毒株的部分核苷酸序列分析
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 疫苗学
作者：徐海明 唐巧英
单位：100024 卫生部北京生物制品研究所
关键词：腮腺炎病毒；序列分析；疫苗；聚合酶链反应
【 摘要 】 目的 比较腮腺炎病毒疫苗株与野毒株的核苷酸序列差异。方法 腮腺炎病毒疫苗株S79株和Jeryl Lynn株在鸡胚细胞上从第5代连续传至第25代,采用逆转录-套式聚合酶链反应(RT-nPCR)法，从传代前后的腮腺炎病毒疫苗株以及野毒株的基因组中扩增血凝素-神经氨酸酶基因片段(HN)、融合蛋白基因片段(F)和小分子疏水蛋白基因(SH)，并利用双脱氧核苷酸链终止法对PCR产物进行测序。结果 传代之前第5代的两种疫苗株的目的基因的核苷酸序列完全一致;传至第25代的S79株的目的基因的核苷酸序列比25代的Jeryl Lynn株显示了更高的突变率。比较现行疫苗株与野毒株的核苷酸序列后发现，1995年分离的野毒株的核苷酸序列与疫苗株有明显的差异。结论 推测S79株可能与Jeryl Lynn株同源，同一地区可能有两种以上的腮腺炎病毒野毒株导致流行性腮腺炎的发生。
Partial nucleotide sequence analysis of vaccine and wild mumps viruses
Xu Haiming, Tang Qiaoying. National Vaccine & Serum Institute, Beijing 100024【 Abstract 】 Objective To compare the nucleotide differences between the vaccine and wild mumps viruses.Methods The S79 strain and Jeryl Lynn strain of Mumps vaccine virus were harvested respectively at the 5th (5P) and 25th(25P) passage levels in chick embryo cell culture , with a reverse transcription nested polymerase chain reaction(RT-nPCR) the genes coding for haemagglutinin-neuraminidase(HN), fusion protein(F) and a small hydrophobic protein(SH) of these vaccine strains and wild mumps viruses were obtained, and they were sequenced by dideoxy chain termination.Results Comparison revealed that the vaccine strains at 5P were identical to each other, but the S79 strain at 25P appeared higher mutation rate than that of the Jeryl Lynn strain at 25P. The nucleotide sequences from the 1995 wild mumps viruses were clearly different from those of the vaccine strains.Conclusions It concluded that the S79 strain and the Jeryl Lynn strain might be from a same origin. The results suggest also the possibility that more than two types of mumps virus could circulate in the same area.
【 Subject words 】 Mumps virus Sequence analysis Vaccine Polymerase chain reaction
我国从70年代起研制腮腺炎疫苗,目前使用的是用S79株生产的单价减毒活疫苗,取得了比较明显的防病效果。经中和抗体试验表明接种 S79株疫苗后血清的阳转率只维持在80%左右, 与报道的接种Jeryl Lynn 株疫苗后血清阳转率为97%尚有一定的差距;同时在国内研制含S79株的MMR的过程中发现,这种腮腺炎疫苗株的免疫原性较弱。自从使用腮腺炎疫苗后,腮腺炎病例的报道虽显著减少,但国内外每年均有流行性腮腺炎的流行发生。近期流行的野毒株是否与现行疫苗株的核苷酸序列存在差异？这些差异是否会影响到疫苗的保护性？鉴于上述原因,本文报道了现行腮腺炎病毒疫苗株和从国内分离的野毒株的部分基因序列。
材料与方法
1.病毒和细胞:S79腮腺炎疫苗株(本所腮腺炎室提供),Jeryl Lynn株(Merck公司); 腮腺炎病毒野毒株：WM1、WM2、WM4、WM5(由本所病毒室1995年自腮腺炎急性期患儿唾液及涂抹腮腺Stensen氏导管出口的棉拭子标本分离);Enders株(购自中国药品生物制品检定所，批号为M.ME 81.3)测序对照；九日龄鸡胚细胞用于培养病毒。
2.腮腺炎病毒的培养：用一定量的腮腺炎病毒接种于鸡胚细胞,35℃静止培养;接种后第4天收集细胞培养液。现行腮腺炎病毒疫苗株S79株、Jeryl Lynn株如此连续从第5代传到第25代,共传20代,每代均培养4天。
3.腮腺炎病毒目的基因的扩增：腮腺炎病毒S79株 、Jeryl Lynn株(第5代及25代)及各野毒株的细胞培养液，经PEG浓缩后采用异硫氰酸胍法提取基因组RNA。引物设计时参照腮腺炎病毒SBL-1株及RW株的cDNA序列 〔1-3〕：引物H1、H2、H3、H4用于扩增血凝素-神经氨酸酶(HN)基因变异区的220个核苷酸片段〔4〕，引物F1、F2、F3、F4用于扩增融合蛋白(F)基因变异区的327个核苷酸片段〔5〕，引物S1、S2、S3、S4用于扩增小分子疏水蛋白(SH)基因的413个核苷酸片段〔6〕。引物具体的核苷酸序列见表1。逆转录合成cDNA，套式PCR法扩增腮腺炎病毒目的基因片段。
表1 PCR引物的核苷酸序列
Table 1. Nucleotide sequences of the PCR primers
| Primer name | Primer polarity | Primer sequence(5→3) | Nucleotide position |
| H1 | Sense | ATTTGTTATTGTCACTTTAG | 216 to 235 |
| H2 | Antisense | AAACTTATTGATTCCATTTA | 500 to 519 |
| H3 | Sense | AGGCTTGAGCAATCAGTT | 264 to 281 |
| H4 | Antisense | AACTAAGGGGATGTTTGT | 466 to 483 |
| F1 | Sense | ATCCTAGAGATCGGG | 1048 to 1062 |
| F2 | Antisense | GCTCAAAACTAAGGC | 1591 to 1605 |
| F3 | Sense | GTAGCACTGGATGGA | 1231 to 1245 |
| F4 | Antisense | ACTCACAGATTGGAG | 1543 to 1557 |
| S1 | Sense | TCAACACAATATCAAGTA | 2964 to 2981 |
| S2 | Antisense | TTCTGTGTTGTATTGTGA | 3401 to 3418 |
| S3 | Sense | ATGATCTCATCAGGTAC | 2988 to 3004 |
| S4 | Antisense | TCCTAAGTTTGTTCTGG | 3384 to 3400 |
4.腮腺炎病毒目的基因的序列测定:扩增后的PCR产物经1%低熔点琼脂糖凝胶纯化回收，用fmolTMDNA Sequencing System (Promega,USA)经双脱氧核苷酸链终止法测序。HN基因片段和SH基因分别采用PCR所用引物H3、H4和S3、S4从扩增片段的两端分别测序，F基因片段采用引物F3从PCR产物的一端测序。样品在LKB MacrophorTM DNA/RNA Sequencer System 中完成测序。
结果与讨论
本实验采用RT-nPCR方法从腮腺炎病毒疫苗株及野毒株中分离并扩增了HN和F基因的变异区片段以及SH基因,经相对分子质量大小鉴定后,表明大小与预期值相同,分别见图1，2，3。根据所测样品的具体序列数据, 将腮腺炎病毒不同株之间的核苷酸序列差异情况进行总结，详见表2～4。
图1 腮腺炎病毒HN基因片段的RT-nPCR结果
Fig 1. RT-nested PCR products of mumps virus HN gene fragment
Lane 1～9:PCR products of HN gene fragments (220bp)
Lane 1:JL(5),lane 2:S79(5), lane 3:WM1, lane 4:WM2, Lane 5:WM4, lane 6:WM5, lane 7:Enders, lane 8:JL(25), lane 9:S79(25)
Lane 10:Low DNA Mass Ladder marker
图2 腮腺炎病毒F基因片段的RT-nPCR结果
Fig 2. RT-nested PCR products of mumps virus F gene fragment
Lane 1～9:PCR products of F gene fragments (327bp)
Lane 1:JL(5), lane 2:S79(5), lane 3:WM1, lane 4:WM2, lane 5:WM4, lane 6:WM5, lane 7:Enders, lane 8:JL(25), lane 9:S79(25)
Lane 10:Low DNA Mass Ladder marker
图3 腮腺炎病毒SH基因的RT-nPCR结果
Fig 3. RT-nested PCR products of mumps virus SH gene
Lane 1～9: PCR products of SH gene (413bp)
Lane 1:JL(5),lane 2:S79(5),lane 3:WM1,lane 4:WM2,lane 5:WM4,lane 6:WM5, lane 7:Enders,lane 8:JL(25),lane 9:S79(25)
Lane 10:Low DNA Mass Ladder marker
表2 腮腺炎病毒株在F和HN基因片段上的核苷酸序列差异比较
Table 2. Comparison of nucleotide differences among mumps virus strains in a region of the F and HN gene
| Virus | F gene | HN gene | ||||||||||||||
| JL(5) | JL(25) | S79(5) | S79(25) | WM1 | WM2 | WM4 | WM5 | JL(5) | JL(25) | S79(5) | S79(25) | WM1 | WM2 | WM4 | WM5 | |
| JL(5) | - | 0 | 0 | 2 | 5 | 6 | 6 | 5 | - | 1 | 0 | 7 | 13 | 13 | 12 | 11 |
| JL(25) | - | 0 | 2 | 5 | 6 | 6 | 5 | - | 1 | 6 | 12 | 12 | 11 | 10 | ||
| S79(5) | - | 2 | 5 | 6 | 6 | 5 | - | 7 | 13 | 13 | 12 | 11 | ||||
| S79(25) | - | 6 | 7 | 7 | 6 | - | 15 | 15 | 14 | 13 | ||||||
| WM1 | - | 1 | 1 | 0 | - | 2 | 1 | 2 | ||||||||
| WM2 | - | 2 | 1 | - | 1 | 2 | ||||||||||
| WM4 | - | 1 | - | 1 | ||||||||||||
| WM5 | - | - | ||||||||||||||
表3 腮腺炎病毒株在SH基因片段上的核苷酸与氨基酸序列差异比较
Table 3. Comparison of nucleotide and amino acid differences among mumps virus in the SH gene range analysed
| Virus | JL(5) | JL(25) | S79(5) | S79(25) | WM1 | WM2 | WM4 | WM5 |
| Nucleotide differences | ||||||||
| JL(5) | - | 1 | 0 | 17 | 6 | 5 | 49 | 55 |
| JL(25) | 1 | - | 1 | 18 | 7 | 6 | 50 | 56 |
| S79(5) | 0 | 1 | - | 17 | 6 | 5 | 49 | 55 |
| S79(25) | 3 | 4 | 3 | - | 21 | 20 | 47 | 53 |
| WM1 | 3 | 4 | 3 | 5 | - | 5 | 48 | 54 |
| WM2 | 2 | 3 | 2 | 3 | 3 | - | 46 | 51 |
| WM4 | 13 | 14 | 13 | 11 | 14 | 11 | - | 9 |
| WM5 | 15 | 16 | 15 | 13 | 16 | 13 | 2 | - |
| Amino acid differences | ||||||||
表4 传代前后疫苗株目的基因片段的核苷酸突变比较
Table 4. Comparison of nucleotide differences between the 5P and the 25P mumps vaccine strains
| Vaccine strain | Nucleotide differences | ||
| F gene | HN gene | SH gene | |
| JL | 0 | 1 | 1 |
| S79 | 2 | 7 | 17 |
腮腺炎病毒S79株最初是由卫生部上海生物制品研究所选育的疫苗株，1992年我们用上海生物制品研究所惠赠的卫制(84)沪(2)04毒株小批量生产腮腺炎疫苗，于1993年获得该疫苗的试生产文号：(93)卫药试字(京)S-01号。按《中国生物制品规程(一部)》的规定生产该疫苗时所用的毒种必须在10代以内，所以我们选择了第5代的疫苗株作为研究对象，并将其连续传至第25代，然后从腮腺炎病毒培养液中提取基因组RNA,通过RT-nPCR的方法分别得到了所需的目的基因片段。测序结果表明,第5代的S79株和Jeryl Lynn株的F、HN 基因片段及SH基因的核苷酸序列完全一致。对传至第25代的两种疫苗株的目的基因的核苷酸序列分析如表5所示: F基因片段上, Jeryl Lynn株序列没有改变,而S79株有2个核苷酸突变;HN基因片段上,Jeryl Lynn株有1个核苷酸突变,S79株有7个核苷酸突变;SH基因上,Jeryl Lynn 株只有1个核苷酸突变,导致SH基因编码蛋白上1个氨基酸序列的突变,S79株则有17 个核苷酸突变,造成SH蛋白上3个氨基酸序列的改变。以上数据说明,在相同的培养条件下,S79 株核苷酸序列的突变率比Jeryl Lynn株更大。我们可以推测,S79株可能与Jeryl Lynn株同源,但比Jeryl Lynn株经历了更多的减毒代次。减毒代次过多会使疫苗株的免疫原性降低〔7，8〕,这从一方面解释了S79株比Jeryl Lynn株免疫原性差的原因。F、HN基因编码的蛋白是腮腺炎病毒的主要抗原,这2个片段上核苷酸序列的改变可能会影响到疫苗的免疫原性。我们将继续研究现行腮腺炎病毒疫苗株各目的基因片段核苷酸突变的起始代次，为疫苗的生产和质控提供有益的参考数据。
表5 腮腺炎病毒野毒株与疫苗株目的基因的核苷酸序列差异比较
Table 5. Comparison of nucleotide differences between the wild mumps viruses and the 5P Jeryl Lynn strain
| Wild mumps viruses | JL(5) | ||
| F gene | HN gene | SH gene | |
| WM1 | 5 | 13 | 6 |
| WM2 | 6 | 13 | 5 |
| WM4 | 6 | 12 | 49 |
| WM5 | 5 | 11 | 55 |
对4个野毒株的目的基因的核苷酸序列用同样的方法进行了分析并与现行疫苗株的序列进行了比较。如表5所示，在F基因片段上,4个野毒株与疫苗株的序列有5～6 个核苷酸的差异,除了WM1 与WM5的序列相同外,这4个国内野毒株之间的差异在1 ～2 个核苷酸左右;在HN基因片段上,4个国内野毒株与疫苗株有11～13个核苷酸的差异,这4个野毒株之间的差异为1～2个核苷酸;在SH基因上,WM1、WM2、WM4、WM5与疫苗株分别有6、5、49、55个核苷酸的差异,其中 WM1和WM2比较接近,有5个核苷酸不同,WM4和 WM5类似,有9个核苷酸不同,这两组之间的差异则较大。以上数据说明,4个国内分离的野毒株在核苷酸序列上与疫苗株都有差异,它们自身之间也有差异,而且在不同的基因片段上差异率不一样,尤以SH基因片段上的核苷酸差异最为显著。据此推测同一地区可能有两种以上的腮腺炎病毒野毒株导致流行性腮腺炎的发生,这与最近的报道相吻合〔9〕。通过分析SH基因编码蛋白的氨基酸序列后发现,不同腮腺炎病毒株因核苷酸序列的变化而导致的氨基酸序列的改变大多为同义突变。
在腮腺炎疫苗的使用过程中,值得注意的是接种疫苗后免疫保护的持续时间。美国早在1967年就开始使用腮腺炎减毒活疫苗,此后病例的报道显著降低,但是1986年～1991年流行性腮腺炎的再度暴发〔10〕,表明了腮腺炎在未接种疫苗的易感人群中的继续流行,也使人们不得不正视这样一个问题:即接种疫苗后引起的免疫保护是否是终生的?这种免疫保护是否有逐渐减弱的趋势?由于疫苗株经过了减毒过程,所以疫苗株与野毒株之间必定存在差异,而且不同时代、不同地区的野毒株也有差异,使用同一种疫苗能否对所有的野毒株进行保护？这些问题尚待进一步探讨,但根据一般的疫苗生产毒种应选用抗原性尽可能与当前流行的病毒相一致的毒株,我们认为在提高疫苗质量的同时,有必要选择新的疫苗株,以达到更好的免疫效果。
文献报道,Jeryl Lynn株又分为两种亚型〔11〕,我们将进一步探讨 S79株中是否也存在这两种亚型或者为这两种亚型中的一种。我们将用现行疫苗株S79株对近期流行的腮腺炎野毒株做保护性对照实验,以进一步评价S79株疫苗的免疫效果。参考文献
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(收稿：1998-03-28 修回：1998-09-21)