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人活化血小板单抗导向血栓免疫偶联物的制备及性质研究
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 免疫检测
作者：孙艳 茹炳根
单位：100871 北京大学生命科学学院蛋白质工程国家重点实验室
目前血栓部位的检测技术大都存在着检测速度慢，灵敏度低，易造成误诊等不足。如果采用高亲和特异性的血栓单抗与核素标记相结合的导向显像方法进行检测，会使检测迅速、灵敏，使血栓的临床检测方法获得突破。
单克隆抗体SZ51对血栓部位活化的血小板α颗粒膜糖蛋白GMP140有很高的亲和特异性〔1〕。我们利用金属硫蛋白(MT)分子的高金属结合特性〔2〕和单抗SZ51对血栓部位的亲和特异性，通过化学偶联的方法，用试剂戊二醛(简记为GL)或碳二亚胺(简记为EDC)将MT和单抗SZ51相偶联，制得导向血栓显像剂，对偶联产物的有关性质进行了研究。通过动物体外血栓模型的显像实验，取得了很好的显像效果，为进一步的动物体内血栓显像和临床研究作了有益尝试。
材料与方法
材料：含单抗SZ51的小鼠腹水由苏州医学院血栓研究所阮长耿教授提供；MT纯品由本实验室供给；Hi-Trap Protein A预装柱购自BIO-RAD公司，偶联试剂戊二醛、碳二亚胺购自Serva公司；常压柱层析系统（Pharmacia公司），UV240紫外可见分光光度计（岛津公司），高效液相系统HPLC(惠普公司)，PU9200火焰原子吸收光谱仪（Phillips公司）。
方法
单抗SZ51的分离纯化：将含单抗SZ51的小鼠腹水以12 500r/min离心20分钟，吸取上清，稀释2倍后，上Hi-Trap Protein A亲和层析柱，收集抗体洗脱峰，透析脱盐冻干备用。
单抗SZ51与MT导向显像偶联体的制备：参照文献〔3〕。
HPLC法计算导向免疫偶联体相对分子质量：采用惠普HPG2000SW（7.5mmD ×30.0mmL）柱，以0.1mol/L PB+0.1mol/L Na2SO4+0.05%NaN3缓冲液作流动相，在280nm处进行紫外检测，根据标准蛋白的保留时间确定偶联体相对分子质量。
导向免疫偶联体免疫活性的测定：采用ELISA法。
导向免疫偶联体金属含量的测定：采用火焰原子吸收分光光度计法（AAS法）。
偶联产物体外血栓模型放射性标记率的测定：具体方法参见文献〔4〕。
结果与讨论
1.由图1的层析图谱和图2的电泳结果可见，利用亲和层析法一步即可将单抗SZ51和腹水中其它杂蛋白分离，分离方法简便而且分离效果显著。
图1 单抗SZ51的分离纯化图谱
A.0.02mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0
B.0.1mol/L critric acid-NaOH,pH3.0
图2 单抗SZ51的分离纯化电泳图
1.单抗SZ51
2.小鼠肝腹水中的总蛋白
2.将纯化得到的单抗SZ51与纯品MT进行化学偶联，偶联体进行SDS-PAGE,同时将标准分子量蛋白与偶联产物通过HPLC分子筛层析，得到SZ51-GL-MT的相对分子质量为25.1×104，SZ51-EDC-MT为22.4×104，见图3。
图3 两种免疫偶联产物的HPLC分子质量分析
蛋白标准：
A.甲状腺球蛋白；保留时间5分钟，相对分子质量6.76×105；
B.白蛋白：保留时间6.7分钟，相对分子质量为6.8×104；
C.核糖核酸酶：保留时间8.6分钟，相对分子质量1.37×104；
D.单抗SZ51：保留时间5.63分钟，相对分子质量1.58×105；
E.SZ51-GL-MT偶联体：保留时间5.1分钟，相对分子质量2.51×105；
F.SZ51-EDC-MT偶联体，保留时间5.04分钟，相对分子质量2.24×105
3.通过ELISA法比较偶联体单抗部分活性的变化结果见图4。从图4的最大抗体稀释倍数（即抗体效价）可知，偶联体SZ51-GL-MT抗体效价为0.25μg/ml，抗体活性低于原单抗；偶联产物SZ51-EDC-MT的抗体效价为0.025μg/mL，此时抗体活性与原单抗相比，几乎没有下降。
图4 免疫偶联物ELISA活性比较条件。
4.通过测定得到：每分子SZ51-GL-MT蛋白含44个金属结合位点，每分子SZ51-EDC-MT蛋白含31个金属结合位点，这与理论值有一定的出入（理论比值为1∶70），究其原因可能是在偶联过程中，抗体与抗体之间，MT与MT之间的无效偶联也使得偶联物的金属离子结合能力与理论值产生了偏差。但总的来看，这两种偶联产物都具有较高的金属结合能力, 为放射性核素的结合与显像提供了必要条件。
从本文的研究来看，单抗SZ51与MT偶联得到的产物既部分或全部保留了原单抗的亲和特异性，又具有高的金属结合特性。进一步比较可知，以戊二醛为双功能试剂制得的偶联物金属结合能力虽强于以碳二亚胺为双功能试剂制得的偶联产物，但由于前者的单抗活性弱于后者，相应会影响其在体内的导向活性，不利于在体内的良好导向性要求。因此，从实用的角度来看，以碳二亚胺为双功能试剂制得的导向免疫偶联体是一种更为理想的导向血栓免疫偶联体。
志谢：苏州医学院血栓研究所提供含单抗SZ51 小鼠腹水，并对偶联产物进行了体外血栓模型放射性标记实验；文章中有关金属含量的测定由本实验室张宛豫老师协助完成，李令媛教授和肖传英老师在试剂与药品的配置方面提供了极大的帮助，在此一并致谢。
本课题为国家九五攻关项目NO. 96-C02-01
参考文献
1 吴国新，奚晓东，李佩霞. SZ51：一株抗人活化血小板的单克隆抗体. 中华血液学杂志，1991，12∶67-69.
2 茹炳根，潘爱华，黄秉乾.金属硫蛋白.生物化学与生物物理进展，1991，18∶254-256.
3 李毕忠，吴永慧，李军. 99mTc通过金属硫蛋白标记抗肿瘤单克隆抗体的研究. 北京大学学报(自然科学版)， 1993,29∶149-155.
4 Wu J, Wu G，Ruan C. Radioimmunoimaging of experimental arterial and venous thrombi in dogs with 99mTc-labelled monoclonal anti-human activated platelet antibody SZ51. Nuclear Medicine Communications，1993,14∶1088-1092.
(收稿：1998-03-28 修回：1998-06-24)