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枯草杆菌对氨茴环霉素的抗性

来源:中华微生物学和免疫学杂志
摘要:枯草杆菌对氨茴环霉素的抗性中华微生物学和免疫学杂志1999年第3期第19卷细菌学作者:唐欣昀EddaDeRossiOrioCiferri单位:唐欣昀230036合肥安徽农业大学生物工程系(获国家教委资助赴意大利访问进修)。EddaDeRossiOrioCiferri意大利帕维亚大学遗传学和微生物学系关键词:枯草杆菌。氨茴环霉素抗性......

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枯草杆菌对氨茴环霉素的抗性

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 细菌学

作者:唐欣昀 Edda De Rossi Orio Ciferri

单位:唐欣昀 230036合肥安徽农业大学生物工程系(获国家教委资助赴意大利访问进修);Edda De Rossi Orio Ciferri 意大利帕维亚大学遗传学和微生物学系

关键词:枯草杆菌;氨茴环霉素抗性;多重药物抗性

  【 摘要 】 目的 研究枯草杆菌对氨茴环霉素(ANC)的抗性特征并克隆抗性片段。方法 用递增浓度方法在LB平板上筛选枯草杆菌菌株1831对ANC的自发抗性突变株,用鸟枪法在枯草杆菌BD224菌株原生质体中克隆抗性重组质粒,提取重组质粒后再次转化敏感菌株以证实克隆片段的抗性功能。结果 对ANC强抗性突变株DM104对化学特性不相关的化合物如溴化乙锭和诺丹明产生交叉抗性。钙通道阻断剂异搏定使突变株失去对氨茴环霉素的抗性。基因克隆获得了4个带有DM104染色体上不同片段的重组质粒,只有1个片段与已知的枯草杆菌bmr基因同源。用重组质粒再次转化敏感菌株证实克隆片段的抗性功能。 结论 枯草杆菌对ANC的抗性呈多重药物抗性特征,这种抗性可能与染色体上多个位点有关。

Resistance of Bacillus subtilis to anthracyclines

TANG Xinyun Edda De Rossi Orio Ciferri.Bioengineering Department, Anhui Agricultural University, Hefei 230036

  【 Abstract 】 Objective To explore the resistance of Bacillus subtilis to anthracycline and clone the fragment responsible for resistance. Methods Spontaneous mutants of strain 1831 of Bacillus subtilis resistant to anthracyclines (ANC) were isolated by selection on LB plates containing increasing concentrations of doxorubicin (up to 100μg/ml). Results These mutants were cross-resistant towards chemically-unrelated compounds such as ethidium bromide and rhodamine. In the presence of a calcium channel blocker, verapamil, mutant DM104 became as sensitive to inhibition by doxorubicin as the parental strain. Four recombinant plasmids containing different fragments of DM104 DNA were obtained by direct gene cloning in protoplasts of B. subtilis BD224 strain, with only one fragment homologous to known bmr gene of B. subtilis. The sensitive strain BD224 became resistant to ANC after retransformed by the recombinant plasmids. Conclusion All data indicate that the mutants display a multidrug resistance mechanism and the resistance may involve more loci in B. subtilis DNA.

  【 Subject words 】 Anthracycline resistance  Multidug resistance  Bacillus subtilis

  在对肿瘤细胞株、实验肿瘤及化疗患者使用氨茴环霉素(anthracyclines, ANC)一个以上疗程后,一般总是出现多重药物抗性现象(multidrug resistance, MDR)[1] 。这种抗性的特征是肿瘤细胞对很多化学性质不相关的细胞毒性药物加快排出,降低摄入。很多报告证实这种抗性的出现与mdr 1基因扩增有关,该基因编码细胞表面一个磷酸化糖蛋白P-170[2] 。Neyfakh[3] 报道了Bacillus subtilis突变株对诺丹明6G、溴化乙锭、氯霉素、嘌呤霉素及其它结构上不相关的药物产生多重抗性。这种抗性也与1个编码多重药物外向运输蛋白的基因bmr的扩增有关。经比较发现,B.subtilis的这种蛋白类似Staphylococcus aureus的氟喹酮外向运输蛋白[4] 和G-细菌中的四环素外向运输蛋白[5] 。Miyauchi等在古细菌Haloferax volcanii也发现了类似MDR蛋白。本文报道B.subtilis对氨茴环霉素的抗性突变株的筛选,突变株的抗性规律及抗性基因克隆。

材料与方法

  1.菌株、质粒及培养条件:B.subtilis 1831菌株(trpC2,phe1)对氨茴环霉素(anthracyclines,ANC)敏感,由意大利帕维亚大学遗传学和微生物学系A.Galizzi博士惠赠。B.subtilis BD224菌株(trpC2,thr5,recE4)、穿梭质粒pCB20(Ampr, Emr)(7595bp)和质粒pBSBMR2(后一质粒是带有bmr基因的pBluescript KS+质粒,bmrB.subtilis BD170的多重药物抗性基因),由Neyfakh博士惠赠[3] 。质粒pCBMR为本实验用pCB20克隆pBSBMR2中bmr基因构建获得。pTE06、pTE10、pTSD1、pTSD6为本实验中用pCB20克隆突变株染色体上抗性片段获得的重组质粒。菌株一般在LB液体或固体培养基37℃培养。

  2.抗生素和抗性测定:阿霉素(doxorubicin, DXR)、表阿霉素(epirubicin, EPR)、碘阿霉素(iododoxorubicin, IDX)、柔红霉素(daunorubicin, DNR)和去甲柔红霉素(4-demethydaunorubicin或idarubicin, IDR)由意大利Pharmacia-Farmitalia Carlo Erba公司化学实验室提供,其它药物为市售商品。定量称取抗生素,溶于无菌水中,-20℃贮存。在LB平板或液体中测定各菌株对抗生素的抗性。

  3.突变株筛选:制备含有不同浓度抗生素的LB平板,在平板上涂上约5×108个对数后期细胞,筛选B.subtilis 1831菌株对DXR、EPR和溴化乙锭的自发抗性突变株,然后逐步增加药物浓度,从自发突变株中筛选强抗性突变株。

  4.遗传操作技术:用碱性方法提取B.subtilis质粒[7] ,用原生质体和感受态细胞法转化B.subtilis BD224菌株[8,9] 。根据文献[10]进行质粒的CsCl梯度离心纯化、琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、bmr片段的32P标记和杂交。

  5.DNA制备和基因克隆:用标准方法[10] 从突变株DM104中提取染色体DNA。用Sau 3AI酶部分降解DNA。质粒pCB20用BamHⅠ酶切开,用小牛肠道碱性磷酸酶去磷酸化。用T4 DNA连接酶连接部分降解的DNA片段和载体。以上各酶均购自Promega或Sigma公司。用制备好的基因表达文库转化BD224菌株原生质体,用下列方法筛选抗ANC克隆:把转化后的原生质体涂在含有10μg/ml红霉素(pCB20标记)的DM3再生培养基上,2~3天后将菌落复印转移至含有2μg/ml的DXR的LB平板上;或把转化的原生质体直接涂在含有2μg/ml DXR的DM3再生培养基上。

结果与讨论

  1.自发突变率:1831菌株在含有10μg/ml DXR和EPR的平板上的自发抗性突变率约为2×10-8,在20μg/ml溴化乙锭平板上的自发抗性突变率约为10-8

  2.突变株的抗性特征:如表1所示,在DXR平板上筛选到抗DXR突变株DM104对EPR和DNR也产生很强抗性,不同突变株间抗性存在差异。同样,在EPR平板上筛选到的突变株也对DXR和DNR产生很强抗性。但是这些突变株对ANC的衍生物IDX和IDR只产生微弱抗性(数据略),与MDR在肿瘤细胞中的表现相似,可能是亲脂的衍生物可快速透过细胞膜而减弱了细胞的泵出效应[11]

表1 突变株对不同药物的抗性(μg/ml)

  Table 1. Resistance level to different drugs of mutant strains

Strains Selected as resistance to Doxorubicin Epirubicin Daunorubicin Ethidium bromide Rhodamin 123
1831 None    1    1 1    2   16
DM058 Doxorubicin   100   18 1   36   128
DM101 Doxorubicin   50   24 -   30   64
DM102 Doxorubicin   50   18 10   20   64
DM104 Doxorubicin >100  >50 12   36 >128
EP201 Epirubicin >100  >50 10   52 >128
EB02 Ethidium   18   20 -   30   64
EB03 Bromide >100  >50 - >100 >128

-:Not tested

  所获抗ANC突变株还对溴化乙锭和诺丹明123产生交叉抗性(表1)。而从含溴化乙锭平板上筛选到的抗性菌株也对诺丹明和ANC类抗生素产生交叉抗性。所获菌株对氯霉素、四环素、链霉素、梭链孢酸、放线菌素D和利福霉素不产生抗性(数据略)。

  在培养基中加10μg/ml的钙通道阻断剂异搏定(verapamil)后,突变株DM104和其出发菌株1831一样对DXR敏感(图1),和其他生物中的MDR的抑制特征相同[1,2,6]

图1 阿霉素和异搏定对出发菌株与突变株DM104生长的影响

  Fig 1. Effect of doxorubicin and verapamil on the growth of the parental strain and the anthracycline-resistant mutant DM104

  Growth conditions as reported under materials and methods. When present, doxorubicin and Verapamil were added at 0 time

  3.基因克隆:用pCB20作为载体,在BD224菌株原生质体中直接进行基因克隆,获得4个抗性较强的重组质粒,其上所带DNA片段长度在1.5~7.0kb之间(图2)。用这些重组质粒再次转化BD224菌株的抗性特征见表2。从表2可见,带有这些质粒的菌株对ANC类抗生素的抗性是对照菌株(不带质粒或只带载体)的10~20倍,高于pCBMR。这些重组质粒还使得细胞对其它药物产生交叉抗性,并且其抗性受到异搏定的明显抑制(表3),表现出和DM104菌株相同的MDR特征。

 图2 重组质粒用AccⅠ和EcoRⅤ酶切琼脂糖凝胶电泳图谱

  Fig 2. The agarose gel electropherogram of recombinant plasmids digested with AccⅠ and EcoRⅤ

  1.pCB20; 2.pTE06; 3.pTE10;4.pTSD1;5.pTS06;6.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ marker;7.λDNA/HindⅢ marker

  表2 BD224菌株用不同重组质粒转化后对药物的抗性(μg/ml)

  Table 2. Resistance to different drugs of BD224 strain transformed with recombinant plasmids

Drugs Plasmids
  - pCB20 pCBMR pTE06 pTE10 pTSD1 pTSD6
Doxorubicin   0.2   0.2    2  4    2  4  4
Epirubicin   0.4   0.4    0.6  2    0.6  2  2
Daunorubicin   0.2   0.2    0.4  2    0.4  2  2
Ethidium bromide  2  2   12 10   12 10 12
Rhodamin 123 18 15 >100 18 >100 25 30

  -:Not plasmid

  表3 异搏定对带重组质粒BD224菌株抗性的抑制

  Table 3. Reversal by verapamil of resistance of BD224 strain with different recombinant plasmids

Drugs Plasmids
pCBMR pTE06 pTE10 pTSD1 pTSD6
Doxorubicin ++ ++ ++ +++ +++
Doxorubicin+Verapamil ± ± ± ± +
Ethidium bromide ++ ++ ++ ++ ++
Ethidium bromide+Verapamil + + + - -

  Effects of verapamil were assessed in LB liquid. verapamil: 25μg/ml;  doxorubicin:2 to 4μg/ml;  ethidium bromide: 4 to 8μg/ml. Being quantitatively inoculated, cultures were grown for 8h and then measured spectrophotometrically at 660nm, and inhibition was expressed as follows:+, growth equal to 20% of the control; ±,less than 10% of the control; -, no growth.

  用pTE06重新转化BD224菌株原生质体后,从含红霉素的DM3再生平板上随机挑取40个菌落接到含DXR的平板上,发现有2个菌落不长,提取质粒电泳后发现这两个菌落细胞中的质粒丢失了原携带的克隆片段,而其它菌落中的细胞都带有完整重组质粒,说明重组质粒中的DNA片段与抗性确实有关。丢失克隆片段的现象在枯草杆菌中是存在的[7] 。用pCBMR上的bmr基因[3] 作探针进行杂交试验,发现只有pTE10上所带的DNA片段与bmr杂交,其它质粒不与bmr杂交。从表2也可看出,pTE10和 pCBMR一样对溴化乙锭和诺丹明具有较强抗性,而对ANC类抗生素抗性较弱。这些数据说明pTE10上带有和bmr相同或同源片段,而其它重组质粒上分别带有不同的抗性片段。

  枯草杆菌突变株DM104对ANC类抗生素产生较强抗性(因逐步加大药物浓度,多次突变结果),并对其他药物产生交叉抗性,其抗性受到异博定的抑制,表现典型的MDR型抗性特征。基因克隆获得4个较强抗性重组质粒,分别带有不同片断,分子杂交结果说明只有pTE10所带片断与bmr同源。用这些重组质粒重新转化敏感菌株BD224后获得的大量菌落都表现比BD224高10~20倍的抗性,本实验中自发突变率为2×10-8,而且克隆片断的丢失也导致抗性的丧失,这些都说明重新转化的菌株的抗性不可能是染色体上基因突变的结果。因为克隆到多个不同片断,说明DM104的抗性涉及多重机理或染色体上多个位点。带有不同重组质粒的BD224菌株的抗性比突变株DM104明显要低,有2个原因。一是BD224比DM104的出发菌株1831对ANC要敏感5倍(表1、2)。二是DM104是经过多次增加药物浓度筛选获得,涉及多次突变,或多个位点突变,而每个重组质粒只带有部分片断,因而只产生较低抗性。在E.coli染色体上已发现多个与MDR现象有关的基因或位点,涉及不同机理[12] 。非特异性多重药物抗性可能在细菌中是普遍现象,本文数据初步证实在B.subtilis中也存在类似情况。有关这些位点的位置、不同基因编码的蛋白质的性质及作用机理有待进一步实验加以探讨。

  参考文献

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  9 Anagnostopoulos C, Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J Bacteriol, 1961,87∶741-746.

  10 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

  11 Nikaido H. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux. Science, 1994,264∶382-388.

  12 唐欣昀.细菌的非特异性多重药物抗性.微生物学通报,1998,25(2)∶107-110.

(收稿:1998-02-23  修回:1998-06-08)


作者: 风清扬 2009-2-21
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