一株新型戊型肝炎病毒的部分克隆及分析

一株新型戊型肝炎病毒的部分克隆及分析

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 病毒学

作者：杨军　张华远　王佑春　毛群颖　李河民

单位：100050 北京，中国药品生物制品检定所

关键词：戊型肝炎病毒；聚合酶链反应；基因异质性

　　【 摘要 】　目的　对得自北京地区一例急性散发性戊型肝炎病人病毒（ChinaT）作基因克隆分析。方法　用逆转录套式聚合酶链反应方法从患者粪便中克隆病毒并做核苷酸序列分析。结果　ChinaT株与4株典型中国株HEV(ChinaA、ChinaB、ChinaC、ChinaD)、缅甸株、墨西哥株、美国株、非洲的乍得株核苷酸/氨基酸同源性分别为78%/92%、78%/92%、79%/90%、78%/94% 、76%/92%。 结论　ChinaT株有较高的基因异质性，与其它HEV株有很大的不同，是一新型HEV。

Partial cloning and analysis of a new hepatitis E virus

YANG Jun, ZHANG Huayuan, WANG Youchun

　　（National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China）

　　【 Abstract 】　Objective　To analyse a hepatitis E virus(ChinaT) isolated from a patient with acute sporadic hepatitis in Beijing. Methods　Partial genome of a hepatitis E virus, designated ChinaT, was amplified from the patient's feces by RT-nested PCR. The PCR products were cloned into pGEM-T vector and sequenced. Results　The sequence was analysed and the results showed that the nucleotide/amino acid identities of ChinaT and other several HEV isolates including four Chinese strains (ChinaA, ChinaB, ChinaC, ChinaD), and stains from Burma, Mexico,US-1 and Chad were 78%/92%, 78%/92%, 79%/90%, 78%/94%, 76%/92%, respectively. Phylogenetic analysis located ChinaT and other HEV strains in different evolutionary branches. Conclusion　ChinaT isolate showed high heterogeneity in genetic background and so was quite distinct from other HEV strains. ChinaT may be a new genotype of HEV.

　　【 Subject words 】　Hepatitis E virus; Polymerase chain reaction; Genetic heterogeneity

　　戊型肝炎病毒，通常通过污染的水源传播，能引起大规模流行及散发性肝炎。自Reyes^〔1〕1990年首次克隆出HEV基因序列以来，新的HEV毒株不断得到发现。本室王佑春等^〔2〕在非甲～戊型肝炎病人发现一新型HEV株。我们又从一例急性散发性戊型肝炎患者的粪便标本中克隆出一HEV株,序列分析发现与其它HEV分离株有较大差别，可能是另一新型HEV。

　　材料和方法

　　样品：急性散发性肝炎病人,临床诊断为戊型肝炎。将其粪便收集后立即-70℃冻存。

　　引物：按照发表的序列,借助OLIGO软件设计引物如下：外引物 正义链 5′-CTTACCCTGTTTAACCTTGCTGAC-3′；反义链 5′-GGAACGCAGAAATGAGAAATAAGC-3′；内引物 正义链 5′-CGGTCTACCGACAGAATTGATTTCG-3′；反义链 5′-GGGGCACAAGCAAATAAACTAT-3′。

　　RNA抽提：10%(w/v)的粪便悬液140μl，按照QIAamp viral RNA kit(QIAGEN产品)试剂盒操作说明抽提病毒RNA。

　　cDNA合成：14.6μl RNA模板，0.7μl dNTPs(10mmol/L)，100pmol反义外引物，0.5μl RNasin(40U/μl,Promega)，2μl DTT(0.1mol/L)，混匀后作短暂离心，70℃ 5min，置于冰上。然后加5μl 10×逆转录酶缓冲液，1.2μl M-MLV(200U/μl)(GIBCO/BRL产品)，总反应体积为25μl。37℃ 1h，90℃ 5min，置于冰上5min。

　　PCR反应：第一轮PCR取2.5μl cDNA，5μl 10×Thermopol reaction buffer，1μl MgSO₄，1μl dNTPs(10mmol/L)，50pmol外引物，1U DNA 聚合酶(以上为New England Biolabs产品)，加超纯水至50μl反应体积。94℃ 1min，60℃ 1min,72℃ 2min，30循环，最后72℃延伸10min。第二轮PCR取1μl第一轮PCR产物，其它同上。

　　PCR产物的纯化及加尾反应：按QIAquick PCR purification kit(QIAGEN产品)操作说明纯化PCR产物后，取4μl PCR产物，2μl 10×PCR buffer，2μl MgCl₂(25mmol/L)，0.5μl dATP(10mmol/L)，2μl Taq DNA 聚合酶(以上为Promega产品)，加超纯水至20μl反应体积，70℃ 30min。

　　克隆测序：将加尾后的PCR产物克隆到pGEM-T载体上，转化至Eco6细胞（本实验室保存），筛选出阳性克隆，用Wizard Plus Minpreps DNA纯化系统提取质粒进行测序。测序反应试剂盒购自Perkin-Elmer公司，用ABI PRISM 377测序仪测序。

　　序列分析：用分析软件对目前报道的5株典型HEV(中国新疆株、缅甸株、墨西哥株、美国株和非洲株)与我们克隆的ChinaT株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较（去除两端引物）。用PHYLIP分析软件(version3.5c;Felsenstein,1993)作进化树分析，首先用DNADIST程序对核苷酸序列作遗传距离的模阵分析(Kimura二参数法)，然后模阵再用NEIGHBOR程序处理(UPGMA设置)，最后用DRAWGRAM作图形输出。

　　从GenBank中调出以下序列以供分析之用：4株中国株HEV，ChinaA(D11092)，ChinaB(M94177)，ChinaC(L25595)，ChinaD(D11093)；缅甸株(M73218)；墨西哥株(M74506)；美国株-1(AF035437)；非洲株Chad(U62121)；巴基斯坦株(M80581)；印度株(X98292)，猪的HEV分离株(AF011921)，(括号中为序列号)。

　　结果

　　从北京地区的一例散发性戊型肝炎病人的粪便标本中克隆出858bp的片段，经BLAST搜索证实为HEV ORF2的3′端基因（6289nt～7147nt），并且其同源性与目前基因库(GenBank, EMBL, DDBJ)中的HEV序列有较大的不同，将该克隆称之为ChinaT。由于我们克隆基因所用的酶的保真性比通常用的Taq酶高2～5倍，结果也应更可靠一些。

　　为了分析与其它已知HEV序列的相似程度，将ChinaT株与中国新疆株(ChinaA)、缅甸株、墨西哥株、美国株-1、非洲株（以乍得株为代表）作了核苷酸和氨基酸的同源性比较（见图1和图2）。分析发现，ChinaT株与这5株HEV核苷酸同源性分别为78%、78%、79%、78%、76%。在氨基酸水平上，其同源性则分别为92%、92%、90%、94%、92%。还将ChinaT株与其它11株HEV作了核苷酸和氨基酸的成对比较（见表1）。在以缅甸株为代表的亚洲株之间该部分的核苷酸/氨基酸同源性为(93～99)%/(98～99)%，而ChinaT株与4株中国株的同源性则为78%/92%，与其它亚洲株的同源性为(77～78)%/92%。结果显示，ChinaT株与其它株HEV相比有着较高的基因异质性，是一株比较独特的HEV株。

　　图2　6株HEV ORF2部分氨基酸同源性比较

　　Fig 2. The amino acid alignment of six HEV strains

　　种系遗传距离结果（见表2）显示，ChinaT株与其它HEV分离株有着相当的演化距离，亚洲株间距离则较近。非洲株同墨西哥株、美国株和ChinaT株相比，更接近于以缅甸株为代表的亚洲株（遗传进化树见图3）。而ChinaT株则似与美国株更相近。

　　图3　12株HEV ORF2的3′端部分(6264nt～7125nt)系统进化树分析

　　Fig 3. Phylogenetic tree of the terminal 3′-ORF2(6262nt～7125nt) of twelve HEV strains

　　讨论

　　对不同地区的HEV株核苷酸序列比较发现，亚洲株和墨西哥株有显著的不同。尽管亚洲株彼此之间非常相似，但可分为两个亚组：东南亚(包括缅甸株，尼泊尔株和部分印度株)和北中亚(包括巴基斯坦株，中国株，Kirghizia株和印度株)^〔3-5〕。非洲的几株HEV基因组也得到了部分测序^〔6，7〕，尽管不同于所有的亚洲株，但非洲株同墨西哥株比较，更和亚洲株相似。上述资料显示，HEV基因组异质性具有地域分布的特征，并可分为4个群：东南亚，北中亚，北美，非洲。最近在美国从猪和一急性肝炎病人分别分离出HEV^〔8，9〕，并归为一个新基因型。

　　但从ChinaT株的分析结果看，该株HEV与其它分离株有很高的基因异质性，是一新型HEV。由于ChinaT株的序列与王佑春发现的新型HEV序列无法比较，二者是同一型还是不同基因型，有待证实。在中国可能存在至少两种以上的HEV基因型。值得注意的是ChinaT株在遗传距离上更接近美国株，而不是亚洲株或中国株，在氨基酸水平上也与美国株及美国猪的HEV同源性最高，分别为94%和95%。

　　图1　6株HEV ORF2的3′端部分核苷酸序列同源性比较

　　Fig 1. The nucleotide alignment of the terminal 3′-ORF2 of six HEV strains

　　The GenBank accession numbers of the prototype of ChinaA, US-1, Burma, Chad and Mexico are D11092, AF035437, M73218, U62121, M74506, respectively

表1　ORF2部分核苷酸及氨基酸成对比较

　　Table 1. Pairwise comparison across partial ORF2

	B	C1	C2	C3	C4	I	P	C	M	U	S	ChinaT
Amino acid identity(%)
B		99	99	99	99	98	99	98	93	92	93	92
C1	93		99	99	99	99	99	98	93	92	93	92
C2	93	98		99	99	98	99	98	93	92	93	92
C3	93	99	98		99	98	99	98	93	92	93	92
C4	94	97	97	97		98	99	98	93	91	93	92
I	94	94	95	94	95		98	98	94	92	93	92
P	93	98	98	98	97	94		98	93	91	93	92
C	89	91	91	91	90	90	91		93	91	93	92
M	80	80	80	80	80	81	80	80		90	91	90
U	78	77	77	77	77	78	77	77	77		98	94
S	79	80	80	80	80	80	80	80	77	91		95
ChinaT	78	78	78	78	78	78	77	76	79	78	78
Nucleotide identity(%)

　　Isolates marked as: B (Burma), C1 (ChinaA), C2 (ChinaB), C3 (ChinaC), C4 (ChinaD), I (India), P (Pakistan), C (Chad), M (Mexico), U (US-1), S (Swine)

表2　DNADIST分析12株HEV遗传距离

　　Table 2. Analysis of genetic distance by DNADIST

	B	C1	C2	C3	C4	I	P	C	M	U	S	ChinaT
Genetic distance
B	0.0000
C1	0.0625
C2	0.0625	0.0124
C3	0.0651	0.0099	0.0124
C4	0.0614	0.0225	0.0276	0.0225
I	0.0560	0.0533	0.0507	0.0533	0.0483
P	0.0718	0.0174	0.0174	0.0174	0.0276	0.0612
C	0.1147	0.0954	0.0926	0.0953	0.0999	0.1038	0.0954
M	0.2309	0.2294	0.2366	0.2297	0.2304	0.2226	0.2316	0.2368
U	0.2627	0.2699	0.2659	0.2713	0.2704	0.2644	0.2734	0.2695	0.2764
S	0.2426	0.2340	0.2319	0.2345	0.2399	0.2304	0.2340	0.2351	0.2784	0.0871
ChinaT	0.2586	0.2596	0.2578	0.2615	0.2590	0.2598	0.2618	0.2724	0.2900	0.2496	0.2527

　　对HEV基因异质性的研究具有重要意义，它涉及到检测试剂的研制、疫苗的开发、流行病学特征以及人源HEV与动物HEV之间的关系研究等。关于ChinaT株的全基因序列、在中国的流行情况、与传统的中国株在致病性上有何异同等，都有待于进一步研究。

参考文献

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(收稿日期：1999-03-28)