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我国登革2型病毒43株PrM-E基因的DNA免疫原性研究
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 病毒学
作者：仝莉莉 秦鄂德 杨佩英 于曼 李同据 欧武
单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所
关键词：登革病毒；PrM-E基因；DNA免疫；非甲基化细菌性CpG
【 摘要 】 目的 观察我国登革2型病毒43株PrM-E基因的DNA免疫原性及非甲基化细菌性CpG对DNA免疫效果的影响。 方法 采用RT-PCR和分子克隆技术构建PrM-E基因片段，并将其插入真核表达载体pBK-CMV中。在证明其可在哺乳动物细胞中高效表达的基础上，进一步用重组质粒DNA免疫小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。 结果 用含PrM-E基因的重组质粒DNA 免疫小鼠可诱导产生登革2型病毒特异的抗体，且产生的抗体在小鼠体内可持续3周以上。用含CpG的pUC19质粒和重组质粒的共免疫与单独免疫重组质粒所诱导的抗体水平没有显著差别。 结论 我国登革2型病毒PrM-E基因重组质粒DNA具有一定的免疫原性。在本实验条件下，含非甲基化细菌性CpG的pUC19质粒DNA，对PrM-E基因的DNA免疫效果没有促进作用。
Study on the immunogenicity of the PrM-E gene DNA of Chinese dengue 2 virus 43 strain
TONG Lili, QIN Ede, YANG Peiying
（Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850,P.R.China）
【 Abstract 】 Objective To study the immunogenicity of the PrM-E gene DNA of Chinese dengue 2 virus 43 strain and the effect of unmethylated CpG motif in the DNA immunization. Methods The PrM-E gene was constructed by RT-PCR and molecular cloning,and inserted into the eukaryotic expressive vector pBK-CMV.BALB/c mice were injected with the recombinant pCMV-ME plasmid DNA contained PrM-E gene interdermally and intramuscularly.The serum of immunized mice was detected for dengue specific antibody by indirect immunofluorescence. Results The high titer of antibody against D2-43 virus persisting for more than three weeks were detected in the immunized mice serum.It was not proved that the CpG of pUC19 could enhance the antigenicity of the recombinant plasmid pCMV-ME in this study. Conclusion The recombinant plasmid DNA of PrM-E gene but not unmethylated CpG was capable of inducting antibodies against D2-43 virus.
【 Subject words 】 Dengue virus; PrM-E gene; DNA immunization; Unmethylated CpG motif
登革病毒的基因组为单股正链RNA，含有一个长的编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白的单一读码框架。在3种结构蛋白(衣壳蛋白C、PrM和E)中，PrM蛋白是膜蛋白M的前体，具有良好的抗原功能区〔1〕。在病毒成熟过程中，PrM蛋白参与包膜糖蛋白E的转运，使其形成正确的三维构象〔2〕。E蛋白位于病毒表面，既含有黄病毒亚群特异的和登革病毒型特异的抗原表位，又有与中和活性相关的B细胞抗原表位以及T细胞抗原表位。由于PrM和E蛋白的相互作用，及多基因抗原编码区可增强宿主的免疫应答，因此以PrM-E蛋白作为登革新型疫苗靶标更具有实际意义。
对于包括登革病毒在内的黄病毒DNA疫苗的研究，目前仍处于探索阶段。我们将构建的我国登革2型病毒株PrM-E基因克隆到真核表达载体pBK-CMV中，在证明其可在哺乳动物细胞BHK中高效表达的基础上，进一步用PrM-E的真核重组质粒DNA免疫小鼠，观察其免疫原性，同时还观察了含有非甲基化细菌性CpG的pUC19质粒对DNA免疫效果的影响。该研究为进一步研制登革DNA疫苗提供了依据。
材料与方法
质粒和菌株：表达载体pBK-CMV为Stratagene公司产品；带有`T'粘性末端的克隆载体pKS-T由Stratagene公司的pBluescriptⅡ KS(+)构建而成。pUC19质粒和大肠杆菌XL1-Blue均由本室保存。
细胞与病毒：白纹伊蚊传代细胞C6/36及地鼠肾传代细胞BHK均为本室保存。登革2型病毒43(D2-43)株为本室1987年自广西登革热病人血清中分离。
试验动物：免疫用小鼠为纯系BALB/c，雌性，3周龄。本院实验动物中心产品。
抗体：登革2型43病毒株的E蛋白的鼠免疫血清多克隆抗体为本所郭庆福教授惠赠，辣根过氧化酶标记羊抗鼠IgG抗体和荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体，分别为Sigma和天象人公司产品。
PrM-E基因及其真核重组质粒的构建：根据D2-43基因组核苷酸序列，设计合成了两对引物，分别用于PrM-E基因的两个片段的扩增。U372(正向引物：372nt～418nt):5′GAAGCT AGC AACCAC CATGGACTC GAGTGC AGG CATGATCAT TAT G3′；L1536(反向引物：1536nt～1506nt):5′CTG TGC ACC AGC CAA GCT TTA TTT TCCATT3′；U1532(正向引物：1532nt～1561nt):5′TGC AAA TGG AAA ATA AAG CTT GGC TGG TG3′；L2389(反向引物：2389nt～2353nt):5′CTC CCA TGT AGA CTA GTT ACA CAG ACAGTG AGGTGC3′。
引物中斜体为外加碱基。其中U372的5′端设计有NheⅠ和XhoⅠ酶切位点，及一个含ATG起始密码子的Kozak序列：CCACCATGG。L2389含有外加的XhoⅠ酶切位点和TTA终止密码子。L1536和U1532中的HindⅢ酶切位点为PrM-E基因中所含有的序列。
从我国病毒株感染的乳鼠脑中提取总RNA，采用RT-PCR方法利用上述引物分别扩增了病毒基因组第372～1536和1532～2389核苷酸序列，即PrM-E基因的5′NH和3′HX两个片段。先将其扩增产物连入pKS-T载体，以获得含有所需粘性末端的基因片段。然后将5′NH和3′HX分步插入到pBK-CMV表达载体的CMV，即早期启动子下游，获得含有PrM-E基因的真核重组表达质粒pCMV-ME。
重组质粒pCMV-ME在哺乳动物细胞中的表达：通过电穿孔方法把pCMV-ME重组质粒DNA导入BHK-21细胞中。用含终浓度为800μg/ml的G418完全培养基进行压力筛选。对筛选出的细胞裂解上清进行SDS-PAGE分析，并用我国登革2型病毒43株E蛋白的抗血清进行蛋白免疫印迹检测，鉴定其特异性。
重组质粒DNA的大量制备与纯化：将重组质粒pCMV-ME转化XL1-Blue菌。于37℃培养至A600(吸光度值)约0.65时，按1%接种量接种于新鲜的含卡那霉素和四环素的双抗性LB培养基中。于37℃，300r/min剧烈振荡培养8h，以活化并扩大培养体积500ml。然后加入终浓度为170μg/ml的氯霉素，继续培养16～18h，离心收集菌体。
用碱裂解法大量制备重组质粒。将制备的重组质粒溶于TE中，再加入预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀后，于4℃，10000r/min离心，以去除大片段RNA。收集上清，用等体积异丙醇沉淀DNA。沉淀经70%乙醇洗涤后溶于500μl含RNA酶(20mg/ml)的TE中，37℃保温1h。然后取1μl，100倍稀释后进行琼脂糖凝胶电泳，当无RNA带存在时，向上述溶液中加入500μl含PEG8000(13%，w/v)的1.6mol/L的NaCl溶液，充分混合，于4℃ 12000r/min离心15min，收集沉淀，并将其溶于400μl TE中。分别用酚和酚∶氯仿各抽提1次。收集的水相用2倍体积的无水乙醇进行沉淀。沉淀用70%乙醇洗3～5次(无菌操作)，并溶于300μl PBS中。取少量溶解物经1∶100稀释后测A260/A280比值，计算质粒DNA浓度。-20℃保存。
BALB/c小鼠的DNA免疫：分别将纯化的pCMV-ME重组质粒，空载体pBK-CMV质粒及pUC19质粒DNA溶于PBS缓冲液中，除pUC19质粒DNA为每只小鼠100μg/次外，其它两种质粒DNA均为60μg/次。免疫途径均为鼠腹部皮内和腿部肌肉同时多点注射。在肌肉注射之前，先在注射部位用100μl的0.5%布比卡因进行麻醉，大约30min后，再注射质粒DNA。
将BALB/c小鼠分为5组，第1组和第2组为实验组，各5只。其余3组为对照组，各2只。第1组，注射pCMV-ME重组质粒DNA；第2组，pCMV-ME+pUC19;第3组，注射pBK-CMV(空载体对照)；第4组，pBK-CMV+pUC19；第5组，仅注射PBS缓冲液。免疫分3次进行。初次免疫后，分别于第15和25天进行加强免疫。在第2次加强免疫的当天和其后的第15和25天(即基础免疫后第40天和第50天时)分别于鼠眼眶取血，分离血清用于抗体检测。
登革病毒抗原片的制备：待C6/36传代细胞长成单层后，接种100～1000 TCID50的登革病毒。于37℃吸附1h后，弃去病毒液，加入含2%小牛血清的RPMI 1640维持液，37℃孵育24～48h。将经吸管打下来的细胞，用3ml含10%小牛血清的生长液制成细胞悬液，滴加在特制的10孔载玻片上。37℃孵育8h，待细胞贴壁后，用PBS洗涤玻片。晾干后用预冷的丙酮固定30min。晾干后于-20℃以下保存备用。
鼠免疫血清的间接免疫荧光检测：将收集的鼠免疫血清用PBST稀释成不同的稀释度，并分别滴加在抗原片的上下两孔内。同时以正常鼠血清作对照。37℃孵育30min，用PBS冲洗抗原片，晾干，每孔滴加用伊文思蓝液稀释的IFTA标记的羊抗鼠IgG。于湿盒内37℃ 30min后，同样用PBS冲洗，晾干后，于荧光显微镜下进行观察，并拍照记录结果。
结果
1.PrM-E基因的真核重组质粒的构建与鉴定：采用RT-PCR方法，利用引物U372和L1536扩增了PrM-E基因的5′片段(5′NH)；利用引物U1532和L2389扩增了该基因的3′片段(3′HX)。首先将这两个基因片段直接克隆到pKS-T载体中，然后用NheⅠ+HindⅢ和HindⅢ+KpnⅠ双酶切，将5′NH片段和3′HX片段从重组的克隆载体中切下后，依次插入到表达载体pBK-CMV中，从此获得了含有全长PrM-E基因的真核重组质粒pCMV-ME(见图1)。构建的我国登革2型病毒株的PrM-E基因片段，包括病毒C蛋白羧基端的PrM-E蛋白的信号肽编码序列、完整的PrM基因和97.8% E基因，全长2019个核苷酸。此外，在PrM-E基因5′端还包括了由PCR引进的含有ATG起始密码子的Kozak序列：CCACCATGG。经酶切鉴定及对构建的PrM-E基因分别从其5′和3′两端进行序列分析，证明PrM-E基因的核苷酸序列是正确的。
图1 重组pCMV-ME质粒的构建
Fig 1. The construction of the recombinant pCMV-ME plasmid
2.重组质粒pCMV-ME在哺乳动物细胞中的表达：将经压力筛选的转染重组质粒pCMV-ME的BHK-21细胞刮下，用PBS洗涤，收集细胞。经SDS裂解后进行SDS-PAGE和Western blot分析。从图2 A中可以看出，在重组质粒pCMV-ME转染的BHK细胞裂解上清中含有1条相对分子质量(Mr)约74×103蛋白带，而正常的和转染有质粒pBK-CMV的细胞对照裂解上清中均无此蛋白带。该蛋白的大小与预期的一致。为进一步证实该蛋白带的特异性，利用登革2型病毒E蛋白的抗血清进行了Western blot分析，从图2B可以看出，表达的Mr为74×103蛋白带可与E蛋白的抗血清起反应，证明该表达蛋白是登革2型病毒特异的。
图2 表达蛋白的SDS-PAGE和Western blot检测结果
Fig 2. Detection of the expressed protein with SDS-PAGE and Western blot
A:Result with SDS-PAGE
1.The supernatant of the lysed normal BHK cell;
2，3.The supernatant of the lysed BHK cell tansfected with pCMV-ME plasmid without being selected by G418;
4.The supernatant of the tansfected BHK cell selected by G418;
5.The supernatant of the lysed BHK cell tansfected with pBK-CMV plasmid;
M.The protein molecular wight marker;
B：Results with Western blot
1.Normal BHK cell;
2.BHK cell transfected with pBK-CMV plasmid;
3，4.The BHK cell tansfected with pCMV-ME plasmid and selected by G418
3.重组质粒DNA的免疫原性：为了检测所构建含有登革病毒PrM-E基因的pCMV-ME重组质粒DNA的免疫原性，通过肌肉和皮内多点注射的多途径同时免疫BALB/c小鼠，免疫剂量每次均为60μg DNA/鼠，并于基础免疫后的第15和25天进行2次加强免疫。对收集的血清，采用DEN2感染蚊细胞的抗原片，通过IFAT方法测定PrM-E抗体产生情况。在用重组质粒DNA第1次加强免疫后的第10天(即初次免疫后的第25天)，即可用我国登革2型病毒感染C6/36细胞的抗原片从小鼠血清中检测到特异荧光。以能检测到特异荧光的最低血清稀释度作为抗体滴度，所检测的5只鼠的平均抗体滴度为1:50。而在注射空载体DNA和PBS的对照组小鼠血清中则未观察到特异荧光。表明含有我国登革2型病毒PrM-E基因的pCMV-ME重组质粒DNA可诱导病毒特异抗体的产生。对第2次加强免疫后的第15和25天(即初次免疫后的第40和50天)收集的血清进行荧光检测，所检测的5只鼠的平均抗体滴度为1:200和1:400。
4.非甲基化细菌性CpG对DNA免疫效果的影响：为观察非甲基化细菌性CpG对pCMV-ME重组质粒DNA免疫效果的影响，本研究将含CpG的pUC19质粒和pCMV-ME重组质粒DNA共同注射小鼠。进行初次免疫和两次加强免疫所用pUC19质粒DNA的剂量均为100μg/鼠，注射途径与时间间隔均与用pCMV-ME重组质粒DNA的免疫相同。于第1次加强免疫后的第10、25和35天分别采血分离血清。同样用DEN2感染C6/36细胞的抗原片通过间接免疫荧光方法检测血清抗体。以能检测到特异荧光的最低血清稀释度作为抗体滴度，所检测的5只鼠的平均抗体滴度分别为1:50、1:200和1:400。可见，这种抗体水平与只注射重组质粒DNA小鼠的没有显著差别。表明在本实验条件下，非甲基化细菌性CpG对登革病毒PrM-E基因的DNA免疫效果没有促进作用。
5.DNA免疫后产生的抗体所持续的时间：为了进一步观察pCMV-ME重组质粒DNA免疫后产生登革病毒特异性抗体所持续的时间，仍采用DEN2感染C6/36细胞的抗原片，对末次加强免疫后第15和25天(即初次免疫后的第40和50天)收集的血清进行荧光检测。从图3可以看出，在初次免疫后的第25天和35天鼠血清中的平均抗体滴度分别为1:200和1:400，呈上升趋势。提示用pCMV-ME重组质粒DNA免疫的小鼠所产生的病毒特异性抗体至少可持续3周以上。对在此之后的特异抗体水平的变化情况，仍在观察之中。
讨论
病毒DNA疫苗的构建，应首先选择编码多种抗原表位的病毒基因靶标和合适的表达载体。本研究之所以选取我国登革2型病毒的PrM-E基因片段，是基于如下考虑：登革病毒的包膜E蛋白是病毒的主要保护性抗原，它除含有可诱导产生病毒中和抗体的表位外，还含有T细胞表位〔3〕。另外，E蛋白的正确折叠有赖于PrM蛋白的协助，并且PrM蛋白也可诱导产生细胞免疫。E和PrM蛋白的联合免疫可增强其免疫原性。因此，本研究所构建的PrM-E基因片段包括了编码全长PrM蛋白和97.8%E蛋白及病毒C蛋白羧基端的PrM信号肽序列。
图3 重组pCMV-ME质粒DNA的鼠免疫血清中登革2型病毒特异抗体滴度
Fig 3. The titres of the dengue-2 virus-specific serum antibodies elicited by recombinant pCMV-ME plasmid DNA
A: First booster immunization; B: Second booster immunization 本研究所选用的真核表达载体pBK-CMV,是在CMV启动子控制下的一种高效表达载体。该载体含有7个CpG motif〔4〕。对DNA免疫机理的研究发现，CpG motif可激活巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12，活化NK细胞分泌IFN-γ，而这些细胞因子可增强TH1类免疫应答〔5〕。pUC19是一种较小的含有氨苄青霉素抗性的克隆质粒，其氨苄青霉素抗性基因(amp-R)中含有2个CpG motif。为观察含非甲基化细菌性CpG的pUC19质粒对DNA免疫效果的影响，我们将100μg的pUC19质粒与pCMV-ME重组质粒DNA共同免疫小鼠。在此实验条件下，没有发现这种pUC19 DNA共免疫可提高抗体产生的水平。目前关于CpG对DNA免疫的影响仍有不一致的报道，Sato和Porter均发现pUC19和重组表达质粒共同免疫动物，可显著提高抗体水平〔3，6〕。但是Colombage在研究墨累谷脑炎病毒(MVE)PrM-E基因的DNA免疫时，用基因枪将pUC19质粒与pcDNA1 PrM-E重组质粒共免疫小鼠，发现pUC19不但不能提高小鼠产生抗体的水平，而且比只免疫重组质粒的还要低〔7〕。这表明，含有CpG的pUC19的免疫刺激作用仍有待进一步探讨。
免疫途径的不同，直接影响DNA的吸收和表达，以及细胞的抗原提呈能力〔8〕。在没有佐剂的情况下，体内DNA的吸收和表达效率与免疫应答水平成正相关。本研究采用多途径免疫结合的方式(肌肉和皮内多点注射)，并且在肌肉注射DNA之前，先在注射部位注射100μl 0.5%的布比卡因进行麻醉。布比卡因的使用造成肌肉局部坏死但很快再生，使得注射的质粒DNA均匀分布，并有利于DNA的吸收。同时，肌纤维的再生可导致质粒DNA转录的增强，从而提高外源基因的表达水平。或许正是由于使用这种麻醉剂及同时进行肌肉和皮内多点注射的多途径免疫，导致DNA免疫后抗体水平大大提高，从而使CpG的免疫刺激作用显得不明显，本研究所用的检测方法下没有观察到pUC19的免疫增强作用。
由于DNA免疫是编码抗原基因的外源DNA在宿主细胞内表达，除诱导产生体液免疫反应外，产生的抗原蛋白经加工处理与MHCⅠ类分子形成复合物提呈到细胞表面，诱导机体的细胞毒淋巴细胞(CTL)的活性，从而对被感染细胞进行识别并发挥杀伤作用。本研究只检测了PrM-E重组质粒DNA免疫后的体液抗体产生情况，目前正进一步检测pCMV-ME重组质粒DNA免疫后所诱导的细胞免疫反应，并观察pUC19和ISS序列是否提高细胞免疫的水平，在此基础上进一步评估pCMV-ME重组质粒DNA免疫在保护动物免受登革病毒攻击中的作用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770036)
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(收稿日期：1999-07-02)