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质粒DNA促进HBsAg-抗HBs复合型疫苗诱生的免疫应答的研究
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 疫苗学
作者：瞿涤 应哲康 王文逸 张悦庆 袁正宏 闻玉梅
单位：上海医科大学 卫生部医学分子病毒学重点实验室
关键词：免疫原性复合物疫苗；DNA疫苗
【 摘要 】 目的 研究HBsAg-抗HBs-质粒DNA复合型疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的类型。 方法 分别以HBsAg、HBsAg-抗-HBs（IC）、pI/AmpHBs、IC-pI/AmpHBs及IC-pI/Amp免疫小鼠，检测抗-HBs的效价，分析抗-HBs IgG亚类（ELISA）；取免疫小鼠脾细胞，体外抗原刺激，用竞争性RT-PCR方法检测IFN-γ及IL-4 mRNA转录水平。 结果 IC-pI/AmpHBs诱生的抗-HBs效价明显高于IC或pI/AmpHBs单独免疫组，其IgG2a/IgG1比值高于IC免疫组，而低于pI/AmpHBs免疫组。IC-pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞在HBsAg刺激下，IFN-γ mRNA转录水平明显高于其他免疫组，其IFN-γ mRNA的T/C（目的片段Target/竞争片段Competitor）比值为IC免疫小鼠脾细胞的10倍；IC-pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞IL-4 mRNA转录水平亦高于其他免疫组，其IL-4 mRNA的T/C比值为IC免疫小鼠脾细胞的2倍。 结论 HBsAg-抗HBs-质粒DNA复合型疫苗在增强体液免疫应答的同时可诱导脾细胞IFN-γ 的表达水平增高。
Plasmid DNA switches on Th1 response in mice immunized with antigen-antibody complex
QU Di, YING Zhekang, WANG Wenyi
（Department of Medical Molecular Virology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, P. R. China）
【 Abstract 】 Objective Our previous study showed that plasmid DNA could substitute alum as an adjuvant to enhance anti-HBs response to hepatitis B surface antigen (HBsAg)-anti-HBs immunogenic complex (IC) in mice (Viral Immunology, 1998, 11:65). In the present study, we further investigated the mechanisms of plasmid DNA on the immunogenicity of IC. Methods BALB/c mice were immunized separately with (a) HBsAg, (b) IC, (c) pI/AmpHBs DNA, a plasmid encoding HBsAg, (d) IC combined with pI/AmpHBs, and (e) IC combined with the vector pI/Amp by i.m injection. Anti-HBs IgG subclasses in mouse serum were analyzed. The expression of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA in spleen cells from mice immunized with HBsAg in vitro were assayed by semi-quantification RT-PCR. Results It was showed that serum anti-HBs titer from group d was the highest among immunized groups, and its ratio of IgG2a/IgG1 reaching 0.91 was higher than that from group a (0.73) and group b (0.82), but was lower than that from group c (1.12). Higher level of IFN-γ mRNA was found in spleen cells of group d and its ratio T/C (target/competitor) was 6.25 and 9.09, at 24 and 48 hours after HBsAg-stimulation. IFN-γ mRNA level detected in group d was tenfold higher than that in group b (T/C ratio 0.83/0.13). T/C ratio of IFN-γ in group a was 0.57/0.02, group c 1.05/0.24 and group e 3.68/0.06. IL-4 mRNA level detected in group d was also higher than that in other groups. T/C ratio of IL-4 in group d was 0.96 and 1.68 at 24 and 48 hours after HBsAg-stimulation meaning twofold higher than that in group b (T/C ratio 0.43 and 0.79). Conclusion Results indicated that plasmid DNA combined with IC switches on Th1 response with no adverse effects on inducing high titer of anti-HBs.
【 Subject words 】 Immunogenic complex vaccine; DNA vaccine
本室曾报道用乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）与抗体（抗-HBs）组建的免疫原性复合物（immunogenic complex, IC）可增强小鼠抗-HBs体液及细胞免疫应答，现已发展为乙肝治疗性疫苗〔1,2〕。DNA疫苗，因其能诱生较强的细胞及体液免疫应答，亦被考虑作为治疗性疫苗用于乙型肝炎病毒（HBV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等持续性感染疾病的治疗〔3，4〕 。 然而, DNA免疫经肌肉注射所需DNA量大，免疫注射技术要求严格，且诱生的抗体效价不如蛋白疫苗高〔5〕。为了根据乙肝患者的不同免疫应答状态，研制与开发既能诱生较强的细胞免疫应答又能增强体液免疫应答的另一种新型治疗性疫苗，我们曾报道HBsAg真核表达质粒DNA在小鼠体内可显著地增强IC诱生的抗-HBs及其脾细胞在HBsAg体外刺激下产生的IL-2水平〔6〕。为进一步研究抗原-抗体-质粒DNA复合型疫苗诱生的细胞免疫应答的类型，通过分析免疫小鼠产生的抗-HBs IgG亚类，及检测小鼠脾细胞IFN-γ及IL-4 mRNA转录水平，结果提示质粒DNA促进了IC诱生的小鼠免疫应答向TH1型转化。
材料与方法
材料和试剂
HBsAg：为自HBsAg阳性血浆分离、纯化，经胃蛋白酶消化及甲醛灭活的抗原制品。
抗-HBs血清：以上述HBsAg加入2mg/ml氢氧化铝，经腹腔免疫BALB/c小鼠，加强后3周取血、分离制备成抗血清，抗-HBs效价为1∶25600（ELISA）。
组建HBsAg-抗-HBs免疫原性复合物：详见参考文献〔1〕。
质粒DNA：真核细胞表达载体pcDNAI/Amp（本文中简化为：pI/Amp）购于Invitrogen。以我国流行的adr型HBV克隆为模板，PCR扩增获得HBV S基因片段，将其插入pI/Amp，构建成HBsAg真核表达质粒，pI/AmpHBs〔7〕。根据本室常规，大量扩增质粒，用QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化质粒DNA，DNA 溶于生理盐水。
试剂：HBsAg及抗-HBs检测试剂盒（上海科华生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG1和IgG2a（The Binding Site Limited Co, 英国），质粒DNA纯化试剂盒（QIAGEN，德国），RPMI 1640培养液、Trizol、鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、六聚体随机引物、RNA酶抑制剂（RNasin）和TaqDNA多聚酶（GIBCO），PCR引物由上海生工公司合成。
实验动物及动物免疫：BALB/c小鼠，雌性，体重16～18g，购于中国科学院实验动物中心。小鼠用戊巴比妥钠（75mg/kg）麻醉后，经双侧胫前肌注射免疫原。免疫原及剂量为：（1）HBsAg 1μg/只；（2）HBsAg-抗HBs IC（含HBsAg 1μg）/只；（3）pI/AmpHBs DNA 100μg/只；（4）IC-pI/AmpHBs，IC（含HBsAg 1μg）及pI/AmpHBs DNA 100μg/只；（5）IC-pI/Amp，IC（含HBsAg 1μg）及pI/Amp DNA 100μg/只。每组5～6只小鼠。初次免疫8周后以相同剂量和途径加强免疫，加强免疫后3周取血检测抗-HBs，或加强免疫后1周取小鼠脾脏行淋巴细胞培养。
抗-HBs测定：以改良的抗-HBs ELISA检测试剂盒测定免疫小鼠血清抗-HBs效价〔6〕；以抗-HBs ELISA检测试剂盒为基础，将酶标羊抗小鼠IgG2a或IgG1作为第二抗体检测抗-HBs IgG亚类。
小鼠脾细胞的分离和培养：无菌取出免疫小鼠脾脏，经碾磨、尼龙网过滤得到单个、分散的脾细胞，Hanks液洗涤1次，以蒸馏水裂解红细胞30min后立即使液体恢复等渗，用RPMI 1640液洗涤1次，将细胞悬浮于RPMI 1640完全培养液（含10％加热灭活胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺、50μmol/L 2-ME）。24孔细胞培养板每孔加入5×106个细胞/ml，5μg HBsAg/ml，置37℃培养箱（5% CO2），于不同时间收集细胞，抽提RNA。
细胞RNA的提取及逆转录：根据试剂盒操作步骤，用Trizol抽提细胞RNA，异丙醇沉淀，将RNA溶于DEPC水，以分光光度计A260nm/280nm定量。取4μg RNA，加入100μmol/L六聚体随机引物，68℃加热5min，冷却后加入逆转录缓冲液、200μmol/L dNTPs、40U RNasin和200U MMLV逆转录酶，置42℃ 1h，94℃加热5min灭活逆转录酶，获得的cDNA置-20℃保存。
竞争性PCR半定量检测IFN-γ和IL-4 mRNA
竞争性模板的构建：通过引物的设计，利用PCR技术删除目的cDNA中的部分核苷酸，从而获得两端核苷酸序列与目的cDNA相同，但长度略短的竞争性模板，通过琼脂糖凝胶电泳可将扩增的目的片段与竞争性模板片段区分开〔8〕。引物序列见表1。
表1 RT-PCR法检测IFN-γ和IL-4 mRNA使用的引物
Table 1. Primers for detection of IFN-γ and IL-4 mRNA by RT-PCR
| Primers | Sequences of primers | Size of PCR
products |
| HPRT sense | 5′-GTTGGATACAGGCCAGA
CTTTGTTG-3′ |
|
| HPRT antisense | 5′-GATTCAACTTGCGCTCA
TCTTAGGC-3′ |
165bp |
| IFN-γ sense | 5′-AACGCTACACACTGCAT
CTTGG-3′ |
|
| IFN-γ antisense | 5′-GACTTCAAAGAGTCTGA
GG-3′ |
237bp |
| IFN-γ competitor
(antisense) |
5′-GACTTCAAAGAGTCTGAGG
CCAGTTCCTCCAGATATC-3′ |
187bp |
| IL-4 sense | 5′-GAATGTACCAGGAGCCA
TATC-3′ |
|
| IL-4 antisense | 5′-CTCAGTACTACGAGTAA
TCCA-3′ |
385bp |
| IL-4 competitor
(antisense) |
5′-CTCAGTACTACGAGTAATCCAGG
ACTCATTCATGGTGCAGCTTA-3′ |
333bp |
竞争性PCR：首先对RT产物进行次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）扩增，根据HPRT条带的密度调整cDNA用量（normalization），使各标本间cDNA用量一致。然后在待扩增的cDNA管中加入一定量的竞争性模板，同管进行扩增。PCR的总反应体积为50μl，含200μmol/L dNTPs，20μmol/L MgCl2，1U Taq DNA多聚酶。PCR循环参数：94℃预变性2min，然后94℃ 1min，60℃退火1min，72℃延伸1min。HPRT及IFN-γ经30个循环，IL-4经35个循环，最后72℃延伸7min。取10μl PCR产物凝胶电泳，经凝胶图象分析系统（上海四星公司）作密度扫描定量分析，计算目的片段/竞争性模板（T/C）的比值。
结果
1.HBsAg-抗-HBs-质粒DNA诱生特异性IgG亚类的分析：在各免疫组别中，IC-pI/AmpHBs及IC-pI/Amp诱生的抗-HBs出现早（初次免疫2周后阳转率达100%），且在加强免疫后IC-pI/AmpHBs及IC-pI/Amp诱生的抗-HBs效价明显高于HBsAg、IC或pI/AmpHBs单独免疫组，如前所报道〔6〕。进而分别检测初次免疫后6周和加强免疫后3周的小鼠血清中抗-HBs IgG亚类（IgG1和IgG2a），检测结果显示：初次免疫小鼠的血清中除HBsAg和IC免疫小鼠的IgG2a含量低于检测水平外，均可检测到抗-HBs IgG2a 和IgG1，其中pI/AmpHBs免疫组产生的IgG2a/IgG1比值最高，见图1。加强免疫后，各免疫组产生的抗-HBs IgG2a和IgG1效价均显著增高，IC-pI/AmpHBs 诱生的IgG2a 效价明显高于IC（t=3.18, P＜0.05）或pI/AmpHBs免疫组（t=2.776, P＜0.05，图1）；同样IC-pI/AmpHBs诱生的IgG1效价亦高于其他免疫组。不同免疫原诱生的抗-HBs IgG2a/IgG1比值分别为：0.73（HBsAg），0.82（IC），0.91（IC-pI/AmpHBs ），0.92（IC－pI/Amp），1.12（pI/AmpHBs）。
图1 免疫原诱导的抗-HBs IgG亚类分析
Fig 1. Analysis of anti-HBs IgG subclasses induced by immunogens
A: HBsAg; B: IC; C: pI/AmpHBs; D: IC+pI/AmpHBs; E: IC+pI/Amp
2.免疫小鼠脾细胞IFN-γ及IL-4 mRNA转录水平的研究
(1)不同培养时间IFN-γ及IL-4 mRNA的转录水平：正常小鼠脾细胞在ConA体外刺激下，培养24、48、72h，以竞争性RT-PCR分别检测IFN-γ及IL-4 mRNA。结果显示IFN-γ mRNA的转录水平于ConA刺激后24h达高峰，而IL-4 mRNA的转录高峰见于72h（图2）。
图2 Con A体外刺激鼠脾细胞中IFN-γ和IL-4 mRNA的表达
Fig 2. Expression of IFN-γ and IL-4 mRNA in mouse spleen cells stimulated with ConA in vitro
HBsAg免疫小鼠脾细胞在HBsAg体外刺激下，IFN-γ mRNA的转录水平于24h达高峰，而IL-4 mRNA于48h达高峰（图3）。
图3 经HBsAg体外刺激，HBsAg免疫鼠脾细胞中IFN-γ和IL-4 mRNA的表达
Fig 3. Expression of IFN-γ and IL-4 mRNA in the spleen cells from HBsAg immunized mice, stimulated with HBsAg in vitro
(2)重组质粒DNA对IC诱生Th细胞类型的影响：不同免疫组小鼠脾细胞在HBsAg刺激下，培养0、24、48h，其IFN-γ及IL-4 mRNA的RT-PCR检测结果显示：IC-pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞IFN-γ mRNA水平明显高于其他免疫组，其IFN-γ mRNA的T/C比值为IC免疫小鼠脾细胞的10倍；IC-pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞IL-4 mRNA水平亦高于其他免疫组，其IL-4 mRNA 的T/C比值为IC免疫小鼠脾细胞的2倍（图4、图5）。
图4 RT-PCR检测IFN-γ和IL-4 mRNA的表达(IFN-γ和IL-4 mRNA T/C比电泳图)
Fig 4. Expression of IFN-γ and IL-4 mRNA detected by RT-PCR
Electrophoresis pattern of IFN-γ and IL-4 mRNA T/C ratio
讨论
持续性病毒感染可见于乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等多种病毒，是微生物学及医学中的重要问题。目前认为，中和抗体、杀伤性T细胞及非杀伤性T细胞所分泌的细胞因子如：IFN-γ、TNF-α等均参与清除病毒〔9，10〕，同时机体产生的免疫应答类型亦与病毒持续性感染相关。因此，在探讨以免疫调控方法终止持续性病毒感染的对策时，加强对机体产生抗病毒免疫类型的分析，对研究具有重要的指导作用。
在免疫应答中，T辅助细胞（TH）调控细胞免疫及体液免疫反应，根据所分泌细胞因子的不同可将TH细胞分为TH1和TH2亚群。在小鼠中，TH1主要分泌IL-2和IFN-γ，促进IgG2a亚类的产生、诱导细胞免疫应答和激活T杀伤性细胞；而TH2则分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，促进IgG1亚类的合成并与变态反应有关〔5〕。为研究抗原-抗体-质粒DNA诱生的T细胞免疫应答类型，本研究分析了免疫小鼠产生的抗-HBs的 IgG亚类：IgG2a和IgG1，并计算特异性抗体的IgG2a/IgG1比值。各组免疫动物中，IC-pI/AmpHBs诱生的抗-HBs总IgG及IgG2a与IgG1的效价最高，其IgG2a/IgG1比值也较高；pI/AmpHBs 诱生的特异性抗体效价低于IC-pI/AmpHBs免疫组，但其IgG2a/IgG1比值最高。HBsAg及IC诱生的抗体IgG2a/IgG1比值较低，但值得注意的是，HBsAg表达质粒DNA或空载体DNA在增强IC诱生抗-HBs效价的同时，还可提高特异性抗体IgG2a/IgG1比值。实验结果显示复合型疫苗中加入质粒DNA，不仅可增强特异性体液免疫应答，还可促使TH0向TH1方向转化。
图5 RT-PCR检测IFN-γ和IL-4 mRNA的表达(IFN-γ和IL-4 mRNA的T/C比直方图)
Fig 5. Expression of IFN-γ and IL-4 mRNA detected by RT-PCR
Histograms of IFN-γ and IL-4 mRNA T/C ratio
我们采用竞争性RT-PCR法检测免疫小鼠脾细胞在特异性抗原刺激下IFN-γ及IL-4 mRNA的转录水平。该方法可通过HPRT调整cDNA的用量，利用竞争性模板控制PCR的管间差异，可较准确地定量检测细胞因子mRNA〔8〕。本研究结果显示：在HBsAg刺激下，HBsAg-抗-HBs-pI/AmpHBs复合型疫苗免疫小鼠脾细胞，IFN-γ mRNA的转录水平明显高于其他免疫组，T/C比值为IC免疫小鼠脾细胞的10倍；IC-pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞，IL-4 mRNA水平亦高于其他免疫组，但IL-4 T/C比值的组间差异不如IFN-γ mRNA显著。因条件所限我们未能对小鼠脾细胞产生细胞因子的情况进行动态观察。本实验中细胞因子mRNA的检测结果与IgG亚类的分析相吻合，更进一步证明IC-质粒DNA可使免疫应答移向TH1型。
现已知DNA疫苗编码抗原所诱生的免疫应答的类型不同于蛋白疫苗，可诱导抗原特异性的TH1细胞分泌IFN-γ及刺激IgG2a亚类的产生〔5〕。DNA疫苗诱生TH1型免疫应答的特性，可用于防治源于TH2应答的变态反应及TH1应答低下的持续性感染疾病，如慢性乙型肝炎、艾滋病等〔3,4,11〕。然而，DNA疫苗诱生的抗体应答低于蛋白疫苗，并需借助脂质体或以细菌及病毒为载体始能诱导粘膜免疫〔5，12〕。本室曾报道HBsAg-抗HBs免疫原性复合物诱生的体液免疫应答高于单纯乙肝疫苗和DNA疫苗，且可诱生粘膜免疫。如以霍乱肠毒素或CpG为佐剂，可提高IC诱生的抗-HBs的IgG2a/IgG1的比值〔13〕。在小鼠中，IC与质粒DNA所组建成的复合型疫苗不仅可诱生高效价的特异性抗体，还可使细胞免疫应答趋向TH1型。因而，在疫苗学的研究中，加深对诱生免疫应答机理的研究，将有助于开发用于不同预防或治疗目的的多种新型疫苗。
志谢：本实验中所采用的细胞因子mRNA检测方法由孙兵研究员传授并在实验过程中得到他的指点，特此表示感谢。
基金项目：国家863高科技计划（Z-18）及国家教委留学回国人员科研启动基金资助项目
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(收稿日期：1999-06-09)