IL-12的真核表达载体促进小鼠对DNA疫苗的免疫应答

IL-12的真核表达载体促进小鼠对DNA疫苗的免疫应答

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 疫苗学

作者：杜德伟　周永兴　冯志华　姚志强

单位：第四军医大学唐都医院感染病防治中心 西安，710038

　　慢性乙型肝炎及其病毒携带者细胞免疫功能明显低下。DNA疫苗可被体细胞摄取并表达相应抗原，激发出保护性免疫应答，包括特异性CTL应答及特异性抗体的产生^〔1〕。IL-12是目前发现对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的细胞因子。我们将HBV DNA疫苗(pCR3.1-S)与编码鼠IL-12的真核表达载体(pWRG3169,简称IL-12)共同免疫小鼠后，观察其对小鼠免疫应答的影响。

　　材料与方法

　　材料：5～8周龄雌性BALB/c小鼠购自本校实验动物中心，体重15～20g;P815小鼠肥大细胞瘤细胞系，编码HBV S抗原的真核表达质粒pCR3.1-S及编码鼠IL-12 p35、p40的真核表达载体pWRG3169均由本室保存。pCR3.1(Invitrogen公司)分子大小为5.0kb，启动子为较强的CMV元件；含牛生长素(BGH)polyA信号及转录终止信号，含新霉素卡那霉素及氨苄青霉素抗性基因LipofectAMINE(美国Gibco公司)、G418、RPMI 1640细胞培养基(美国Sigma公司)、小牛血清(杭州四季青公司)、抗HBs ELISA检测试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG均购于华美西安公司，小鼠抗HBs、抗小鼠CD4⁺、CD8⁺单克隆抗体购于武汉博士德公司。

　　质粒转染P815细胞及表达产物的检测：用碱裂解法大量提取质粒，并经聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化。采用脂质体转染技术将纯化后的pCR3.1-S质粒转染P815细胞，用含G418(350mg/L)细胞培养基筛选，当对照细胞大部分死亡后，换含G418(150mg/L)的细胞培养基培养约2周，以间接免疫荧光法检测转染细胞内HBsAg的表达，表达HBsAg的细胞作为杀伤实验中的靶细胞。

　　质粒免疫及抗HBs检测：将20只小鼠随机分为4组，每组5只，5g/L布比卡因+10g/L对羟基苯甲酸甲酯处理小鼠股四头肌肉，24 h后同一部位注射质粒。第1组注射100μg pCR3.1空载体，第2组注射pCR3.1和pCR3.1-S各50μg，第3组注射pCR3.1-S+IL-12各50μg，每2周1次，连续8周。第4组仅注射pCR3.1、pCR3.1-S各50μg 1次。每2周采血40μl分离血清，ELISA法检测抗HBs，操作按说明书进行。

　　小鼠特异性CTLs杀伤活性测定：免疫8周后，无菌条件下取小鼠脾脏，研磨过滤，制成单细胞悬液，①用4 h⁵¹Cr释放法直接测定CTLs杀伤效应。②先在效应细胞内分别加入CD4 McAb及CD8 McAb，再加入靶细胞测定CTLs杀伤效应，效应细胞∶靶细胞(E∶T)为100∶1。

　　结果与讨论

　　pCR3.1-S免疫1次，小鼠血清抗HBs在6周达到高峰，以后开始下降，多次免疫抗HBs随免疫次数增加而增加。IL-12可以提高小鼠抗HBs滴度，在任何时间点联合免疫与单纯DNA疫苗相比均有显著差异(图1)。DNA疫苗可诱导很强的CTLs杀伤活性，IL-12可明显提高小鼠脾细胞HBsAg特异性CTLs杀伤活性。含有HBV基因S区的DNA疫苗与编码IL-12的真核表达载体共同免疫小鼠，多次免疫较1次免疫诱导的免疫应答高，小鼠血清抗HBs随免疫次数增多而增加，IL-12真核表达载体可明显提高基因疫苗诱导的免疫应答，联合免疫小鼠血清抗HBs在任何时间点均较单纯HBV基因疫苗免疫组明显增高。效应细胞内加入CD4 McAb，CTLs杀伤活性无明显改变；而CD8 McAb使CTLs杀伤活性明显下降。与对照组相比差异有显著性(图2)。Davis等^〔2〕用HBV DNA疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，发现DNA疫苗可以使对HBsAg无应答的转基因小鼠产生免疫应答。用HBV变异株DNA免疫小鼠诱生的抗体低于野毒株^〔3〕。体外杀伤实验证实，DNA疫苗可明显提高小鼠脾细胞的CTL杀伤率，IL-12的真核表达载体可明显提高DNA疫苗诱导的CTLs反应。用抗CD8⁺单克隆抗体处理效应细胞后CTLs的杀伤效应明显降低，而抗CD4⁺单克隆抗体对CTLs的杀伤效应无明显影响。证明CTLs杀伤作用主要由CD8⁺T淋巴细胞完成。与国外文献报道一致^〔4〕。

　　图1　IL-12真核表达载体对HBV基因疫苗诱导小鼠抗HBs的影响

　　a. P＜0.001vs pCR3.1； b. P＜0.01vs pCR3.1-S

　　图2　IL-12真核表达载体对HBV基因疫苗诱导CTLs杀伤活性的影响

　　a. P＜0.001vs pCR3.1； b. P＜0.01vs pCR3.1-S

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770665)

　　参考文献

　　1，Schirmbeck R, Bohm W, Ando K, et al. Nucleic acid vaccination primes hepatitis B virus surface antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in nonresponder mice. J Virol, 1995, 69:5929-5934.

　　2，Davis HL, Brazolot Millan CL, Mancini M, et al. DNA-based immunization against hepatitis B surface antigen(HBsAg)in normal and HBsAg-transgentic mice. Vaccine, 1997, 16(8):849-852.

　　3，何建文，武力，姚忻，等.乙型肝炎S基因129 Leu和145 Arg变异株的抗原表达与DNA免疫研究.中华微生物学和免疫学杂志，1999，19(3)：201-205.

　　4，Saito T, Sherman GJ, Kurohchi K, et al. Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins:immune responses in mice. Gastroenterology, 1997, 112:1321-1330.

(收稿日期：1999-12-04)