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中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 临床免疫学
作者：王海滨 郭峰
单位：200433 上海，第二军医大学长海医院免疫室
关键词：肝肿瘤；红细胞；淋巴细胞；免疫粘附
【 摘要 】 目的 探讨晚期肝癌患者红细胞和淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫粘附能力。 方法 采用红细胞和淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞及红细胞促淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞实验方法，对43例晚期肝癌患者进行研究。 结果 晚期肝癌患者红细胞和淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞能力都明显下降（P＜0.01），特别是淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫粘附功能下降更明显。肝癌患者和正常人的红细胞对自身淋巴细胞具有免疫粘附促进作用，但肝癌患者红细胞对自身淋巴细胞的免疫粘附促进作用明显低于正常人（P＜0.05）。 结论 红细胞、淋巴细胞免疫粘附肿瘤功能试验，可考虑作为肝癌患者免疫功能测定指标之一，红细胞免疫粘附功能的变化在晚期肝癌疾病发展及预后中具有一定作用。
The study of red blood cells and lymphocytes immune-adhering to tumor cells in advanced liver cancer
WANG Haibin, GUO Feng.
（The Department of Immunology, Changhai Hospital, The Decond Military University, Shanghai 200433, P. R. China）
【 Abstract 】 Objective To study the adhering of red blood cells and lymphocytes to tumor cells from the patients of advanced liver cancer. Methods The immune-adhering test of red blood cells and lymphocytes to tumor cells and the modulation test of red blood cells to lymphocytes have been used. Results The immune adhesion ability of red blood cells and lymphocytes to tumor cells from healthy individuals and patients with advanced liver cancer was both obviously lower than that of healthy individuals (P＜0.01). Red blood cells of both the patients of advanced liver cancer and healthy individuals can significantly promote the adhering of lymphocytes to tumor cells, but the former was weaker than that of the latter. Conclusion The immune adhesion test of red blood cells and lymphocytes to tumor cells can be regarded as an important judgment line in immune-related diseases. And the modulation function of red blood cells plays an important role in development of the diseases.
【 Subject words 】 Advanced liver cancer; Red blood cell; Lymphocyte; Immune-adhesion
红细胞不但能免疫粘附肿瘤细胞，而且胞浆中具有含量丰富的NK细胞增强因子（NKEF），可显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤〔1〕，在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的作用。免疫粘附是免疫应答和免疫反应的重要组成部分，研究红细胞和淋巴细胞的免疫粘附功能，对了解肿瘤及免疫功能缺陷性疾病的整体免疫功能状况具有重要参考价值。本研究表明，晚期肝癌患者红细胞和淋巴细胞的免疫粘附功能明显低于健康正常人。研究结果报告如下：
研究对象与方法
研究对象：本院体检化验中的健康者59人。临床确诊并辅以病理诊断为晚期肝癌的住院患者43例，平均年龄67.56岁，男34例，女9例。
效应细胞的制备：肝癌患者及健康对照新采集的外周肝素抗凝血2ml用Ficoll分离液常规分离淋巴细胞，淋巴细胞纯度在95%以上，用Hanks液洗2次(2?000r/min，5?min)，用RPMI 1640配成浓度为107备用；取分离的红细胞，用0.9%的生理盐水洗涤2次(2?000r/min，5?min)，常规镜检无白细胞，配成108/ml备用。
癌细胞悬液：培养活艾氏腹水瘤细胞；冻干肿瘤细胞为本室自制。两者在使用时用0.9%的生理盐水洗2次。用台盼蓝染色检查肿瘤细胞的活性。
小鼠正常细胞：小鼠正常成纤维细胞，用胰消化酶消化去掉纤维组织，将细胞分散并配成107/ml，然后立即进行人淋巴细胞与小鼠正常细胞的免疫粘附实验。
肿瘤细胞的致敏：将洗涤的癌细胞悬液，用正常人混合血清1.5ml致敏，37℃水浴40?min，Hanks液洗涤2次，配成106/ml待用。
红细胞免疫粘附肿瘤细胞功能测定（RIT）：在试管内加0.025ml红细胞悬液和0.05ml癌细胞悬液，混匀，置37℃水浴40?min；取出加生理盐水0.1ml轻旋转混匀，再加0.25%戊二醛0.025ml轻旋转混匀，室温固定5?min，全部取出置一标记载玻片中央，滴加适量瑞吉氏染液，悬浮水平涂片，于640×光镜下静置1～2?min后阅片。肿瘤细胞呈紫红色，红细胞呈浅黄色，一个肿瘤细胞结上5个或5个以上红细胞为一个花环，计数200个肿瘤细胞，计算花环率（%）。
淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞功能测定（LIT）：在试管中加入0.05ml已配制好的淋巴细胞悬液，0.05ml肿瘤细胞悬液和0.05ml小牛血清混匀，低速离心1～2?min(500r/min)置37℃水浴40?min，取出加生理盐水0.1ml，轻旋转混匀，然后加入0.25%戊二醛0.025ml轻旋转混匀，室温固定5?min，涂片方法同上。计数200个肿瘤细胞，粘附2个或2个以上淋巴细胞(深蓝色)的肿瘤细胞为一朵花环，计数花环结合率（%）。
红细胞促进淋巴细胞粘附肿瘤细胞能力测定（RELIT）：在试管中加入0.05ml淋巴细胞悬液、0.025ml红细胞悬液、0.05ml肿瘤细胞悬液和0.05ml小牛血清混匀，低速离心2?min（500r/min）置37℃水浴40?min，取出加生理盐水0.1ml，轻旋转混匀，然后加入0.25%戊二醛0.025ml轻旋转混匀，室温固定5?min，取1/2瑞吉氏染色涂片，湿片计数：（1）肿瘤红细胞花环率；（2）肿瘤淋巴细胞花环率；（3）肿瘤红细胞和淋巴细胞混合花环率。计数200个肿瘤细胞。其中，一个肿瘤细胞结上2个或2个以上的淋巴细胞和2个以上红细胞为一朵混合花环，只结合5个或以上红细胞的为1个肿瘤红细胞花环，只结合2个或以上淋巴细胞的肿瘤细胞为一个肿瘤淋巴细胞花环。分别计算花环率。
人淋巴细胞与正常小鼠成纤维细胞粘附实验：用小鼠正常成纤维细胞代替肿瘤细胞，其它步骤与淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞测定方法相同。
数据处理：采用配对与未配对计量资料Students检验。
结果
1.晚期肝癌患者与正常人红细胞和淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞能力比较：43例晚期肝癌患者红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力明显低于正常人（P＜0.01），其中，中央型肝细胞癌患者的红细胞粘附能力较周边型患者更低（P＜0.05）。患者的淋巴细胞粘附肿瘤细胞能力亦明显低于正常人（P＜0.01），其变化幅度比红细胞粘附能力显著。见表1。
表1 晚期肝癌患者与正常人红细胞和淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞能力比较(
Table 1. The immune adhesion of red blood cells and lymphocytes to tumor cells from healthy individuals and patients with advanced liver cancer (
| Groups | n | RIT | LIT |
| Healthy individuals | 40 |
65.8±4.11 |
21.73±1.99 |
| Advanced liver cancer | 35 | 34.1±3.25* | 9.69±2.10* |
Note: Compared to control groups, *P＜0.01
RIT：Red blood cells immune-adhering tumor cells test
LIT：Lymphocytes immune-adhering tumor cells test
2.晚期肝癌患者与正常人红细胞调节淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞能力的比较：红细胞对自身淋巴细胞具有明显的免疫粘附促进作用。从表2可看出，肝癌患者红细胞对自身淋巴细胞的免疫粘附促进作用明显低于正常人群，肝癌患者红细胞对淋巴细胞的结合促进率为66.1%，正常人为84.1 %，二者差异有显著性(P＜0.01)。表明肝癌患者的红细胞对自身淋巴细胞的免疫粘附调节功能可能存在不同程度的缺陷。
表2 晚期肝癌患者与正常人红细胞调节淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞能力比较(
Table 2. The modulating effect of red blood cells from both patients and healthy individuals on the adhesion of lymphocytes to tumor cells(
| Groups | n | RIT | LIT | RELIT |
| Healthy indivi-
duals |
40 |
40.2±2.95 |
28.7±1.08 |
11.3±1.47 |
| Advanced liver cancer |
35 | 9.3±1.56* | 10.5±2.10* | 5.6±2.65* |
Note: Compared to control groups, *P＜0.01
RIT，LIT： Same to table 1
RELIT：Red blood cells enhancing lymphocytes immune-adhering tumor cells test 3.晚期肝癌患者与正常人淋巴细胞对小鼠活肿瘤细胞和正常成纤维细胞的免疫粘附能力比较：正常人与晚期肝癌患者的淋巴细胞对小鼠正常成纤维细胞亦有粘附现象，但其粘附花环率远低于对肿瘤细胞的粘附花环率（P＜0.01），肝癌患者及正常人群淋巴细胞对小鼠正常成纤维细胞的粘附花环率差别不显著（表3）。淋巴细胞对活肿瘤细胞和冻干肿瘤细胞的免疫粘附差异无显著性，但粘附到活肿瘤细胞上的淋巴细胞数量明显比粘附到冻干肿瘤细胞上的淋巴细胞数量多。这可能是由于在冻干过程中有肿瘤抗原的破坏。此实验结果表明小鼠艾氏腹水瘤细胞存在肿瘤特异性抗原。RBC可与多种人癌细胞粘附已有报道〔2〕。
表3 肝癌患者与正常人淋巴细胞对小鼠正常成纤维细胞与活肿瘤细胞和冻干肿瘤细胞粘附能力比较(
Table 3. The adhesion ability of lymphocytes from healthy individuals and patients with advanced liver cancer to normal fibrin cell, live tumor cells and freeze-dry tumor cells of mouse (
| Groups | n | NFC | LTC | FDTC |
| Healthy indivi-
duals |
19 |
5.2±2.14 |
22.0±1.57 |
20.69±2.15 |
| Advanced liver cancer |
8 | 4.8±1.76* | 11.3±2.05** | 9.87±1.92** |
Note: Compared to healthy individuals, *P＞0.05; **P＜0.01; NFC: normal fibrial cell; LTC: liver tumor cell; FDTC: freeze-dry tumor cell; NFC vs LTC or FDTC in healthy persons and liver cancer, P＜0.01; FDTC vs LTC in healthy persons and liver cancer, P＞0.05讨论
肝细胞癌的发病机制尚未明确，但机体整体免疫功能特别是非特异性免疫功能状况与疾病的发生发展有非常重要的关系，其中，免疫监视系统功能状况是决定机体随机突变的癌前细胞能否发展成为癌细胞的关键。目前已证明，红细胞膜上广泛存在的膜分子，如CR1在循环免疫复合物的清除及淋巴细胞功能活化中具有重要调节作用；CD58分子作为CD2分子的天然配体在T淋巴细胞活化的信号传递中具有重要意义；CD59作为补体后段调控蛋白亦是CD2分子的天然配体，对T细胞的活化亦具有重要调节作用；CD44分子作为一种重要的粘附分子，在红细胞上分布最为广泛，在淋巴细胞的发育、归巢（homing）、肿瘤转移、细胞激活和信号传导中有重要作用〔3〕；红细胞浆内存在含量丰富的NK细胞增强因子（NKEF）〔1〕，NKEF具有较强的增强NK细胞杀伤肿瘤细胞的效应，这在机体防癌和抗癌过程中具有十分重要的意义。免疫粘附是细胞发挥其特异性和非特异性免疫反应的重要步骤。红细胞在机体血细胞中数量最多，整体而言，不可忽视红细胞在非特异性免疫功能中的重要作用。研究红细胞的免疫粘附功能及对其它细胞的免疫调节作用，对了解机体整体免疫状况具有一定的理论及临床意义。
本研究结果显示，晚期肝癌患者红细胞和淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞能力都明显下降（P＜0.01），特别是淋巴细胞对肿瘤细胞的粘附能力下降更显著。肝癌患者红细胞对自身淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞的调节作用明显低于正常人群（P＜0.05）。人的淋巴细胞对小鼠成纤维细胞无明显的粘附作用，而对小鼠肿瘤细胞则有较强的粘附作用，说明淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫粘附现象属肿瘤特异性。结合病理结果分析发现，肝癌患者红细胞对肿瘤粘附能力的变化与其病理分型有一定的关系；结合临床还发现，肝癌患者红细胞和淋巴细胞对肿瘤细胞的粘附功能变化，与疾病的严重程度有一定的关系，表明红细胞和淋巴细胞的免疫粘附功能试验可作为临床免疫的测定指标，对临床病情判断有重要的参考价值。本研究还表明，红细胞作为机体数量最多的血细胞，不但在机体整体免疫平衡中具有重要的调节作用，而且在疾病的发生、发展及预后中亦具有重要意义。因此，对红细胞免疫粘附能力的研究具有重要的基础医学和临床医学价值。
参考文献
1，Shau H, Kim A. Identification of natural killer enhancing factor as a major antioxidant in human red blood cells. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 199(1):83-88.
2，郭峰，黄盛东，赫丽，等. 红细胞在肿瘤免疫反应中的作用. 中华微生物学和免疫学杂志, 1995, 15(3):183-187.
3，Sommer F, Hubre M, Rpllinghoff M, et al. CD44; plays a co-stimulatory role in mouse T cell activation: ligation of CD44 selectively co-stimulates IL-2 production, but not proliferation in TcR-stimulated moiré Th1 cells. Int Immunol, 1995, 7:1779-1786.
(收稿日期：1999-05-03)