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肾移植患者T淋巴细胞核仁组织区嗜银蛋白的监测
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 临床免疫学
作者：赵继懋 张玉海 唐淑珍
单位：首都医科大学附属北京友谊医院泌尿科，100050
关键词：肾移植；DNA；核蛋白体；嗜银蛋白；T细胞亚群
【 摘要 】 目的 研究外周血T淋巴细胞核中的rDNA转录活性在异体肾移植手术前后的变化及其敏感性。方法 异体肾移植手术前后取外周血T淋巴细胞，检测核仁银染面积与核面积的比值（Ag-NORs），同时取血做T淋巴细胞表面抗原测定和病毒抗体检测。结果 外周血T淋巴细胞Ag-NORs 含量由术前的（6.29±0.97）%，分别下降为术后1周的（4.63±0.90）%，术后2周的（4.81±1.6）%和术后3周的（4.56±1.2）%。手术前的Ag-NORs值与术后不同时期的Ag-NORs值比较差异有显著性（P＜0.05）。术后不同时期的Ag-NORs值之间差异无显著性(P＞0.05)；Ag-NORs值不受性别及有无病毒感染的影响。T淋巴细胞表面抗原测定，CD3、CD4、CD8、CD4/CD8等手术前后无显著性变化，也不受病毒感染的影响。结论 外周血T淋巴细胞Ag-NORs值可用于肾移植患者的免疫监测；在免疫低下人群中用Ag-NORs值监测免疫状态较T淋巴细胞表面抗原测定敏感。
Clinical research on the rDNA transcription activity of peripheral T lymphocyte in renal allograft recipients
ZHAO Jimao, ZHANG Yuhai, TANG Shuzhen.
(Beijing Friendship Hospital, Beijing 100050, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective Exploring the significance of rDNA transcription activity of peripheral blood T lymphocyte in renal allograft recipients.Methods rDNA transcription activity of peripheral T lymphocyte was detected by a cell image analysis of Ag-NORs in the patients received kidney transplantation. The peripheral blood was collected before the transplantation and in the first, the second and the third week after the operation, respectively. T subsets and antiviral-IgM were also detected.Results rDNA transcription activity of T cells decreased from 6.29±0.97(%) before the operation to 4.63±0.90(%) in the first week, 4.81±1.6(%) in the second week and 4.56±1.2(%) in the third week after operation, showing a statistically significant difference between preoperation and postoperations. No significant difference of Ag-NORs in T lymphocytes had been found for since the operation. T subsets (CD3, CD4, CD8) and CD4/CD8 did not change in the perioperation period. The value of Ag-NORs was not influenced by gender and serum antivirus IgM antibodies level. So did T subsets.Conclusion rDNA transcription activity of T cells might be used to monitor the immune function in renal allograft recipients. And Ag-NORs of T cells might be a better method than T subsets array in monitoring immune activity in patients with immune defects.
【 Subject words 】 Kidney transplantation; DNA,Ribosomal; Ag-NOR; T subset
核仁组织区嗜银蛋白（Ag-NORs）是判别细胞核中rDNA转录活性的一个指标，可通过测定核仁银染面积与核面积的比值说明其嗜银的强度，广泛应用于肿瘤的研究。近年来有人通过测量外周血T淋巴细胞核中的rDNA转录活性观察肿瘤患者的免疫状态，用于早期肿瘤的诊断。我们采用KL型肿瘤免疫图象分析系统对同种异体肾移植手术前后患者外周血T淋巴细胞进行了Ag-NORs测定，研究外周血T淋巴细胞Ag-NORs测定在异体肾移植中的应用前景。报告如下：
材料和方法
标本：同种异体肾移植手术患者，分别于手术前及手术后1、2、3周无菌操作下抽空腹静脉血，用肝素抗凝，及时送检。进行Ag-NORs测定、T淋巴细胞表面抗原测定和病毒抗体的检测。
Ag-NORs测定方法
1.主要仪器和试剂：KL型肿瘤免疫图象分析系统，北京开隆医疗仪器公司产品。试剂：RPMI 1640培养液，GIBCO产品；银染液（5%硝酸银）、固定液及其它配套试剂由开隆医疗仪器公司提供。
2.方法
(1) 培养：无菌条件下取0.5ml抗凝血加到含RPMI 1640培养液的瓶中，置37℃培养箱中72 h后，加2滴终止液，继续培养2 h后取出。
(2) 制片：将培养的细胞悬液轻轻混匀并吸到5ml离心管中，1 000r/min离心10 min；弃上清液后加入5ml低渗液，混匀置37℃ 20 min；加5ml固定液，混匀、离心后弃上清，重复1次；沉淀中加0.3ml固定液，取2～3滴于预冷的玻片上，晾干。
(3) 银染：90℃水浴箱上置铝板，玻片置其上，热后加染液A 4滴，染液B 2滴，盖玻片，涂片成深黄色时取下，净水冲净，自然晾干。
(4) 图象分析：将染片置于显微镜载物台上，对焦，启动分析程序。计算30个T淋巴细胞核仁银染面积与细胞核面积比值。
T淋巴细胞表面抗原测定：采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）桥联酶标技术，试剂盒由北京军事医学科学院基础医学研究所提供。
病毒抗体的检测：ELISA测定试剂盒检测外周血IgM抗体，由北京科斯塔高科技生物工程公司提供。
统计学方法：采用t检验、双因素方差分析及Student-Newman-Keuls两两比较，显著性水准α=0.05。
结果
1.一般资料：共有55例患者进入本实验。平均年龄41.1±10.6岁。其中男35例，年龄39.0±11.4岁；女20例，年龄44.7±7.9岁。术后采用三联用药方案（环胞素A、硫唑嘌呤、泼尼松）预防排斥反应。在本研究期限内未出现移植肾排异或感染、发烧等并发症。
2.外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量的变化：外周血T淋巴细胞Ag-NORs 含量手术前为（6.29±0.97）%，在肾移植手术后下降，分别为术后1周的（4.63±0.90）%，术后2周的（4.81±1.6）%和术后3周的（4.56±1.2）%。统计学分析表明，手术前的Ag-NORs值与术后不同时期Ag-NORs值比较差异有显著性（P＜0.01）。术后不同时期Ag-NORs值之间差异无显著性(P＞0.05，见表1)。手术前后不同时期的Ag-NORs值男女之间差异亦无显著性。
3.术前外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量与多种抗病毒抗体的关系：所测抗病毒抗体阳性者Ag-NORs含量低于抗体阴性者，但统计学分析两组间差异无显著性(P＞0.05，见表2)。
4.外周血T淋巴细胞表面抗原的变化：测定T淋巴细胞表面抗原CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值等，术后第1周均有不同程度的升高，术后第2、3周下降并低于手术前的水平，但统计学分析手术前后差异无显著性（见表3）。
表1 肾移植病人手术前后T淋巴细胞Ag-NORs含量的变化
Table 1. Changes of Ag-NORs in T lymphocyte from renal allograft transplant recipients in the perioperation period
| Monitor time | n | Ag-NORs(%) |
| Preoperation | 23 |
6.29±0.97 |
| Postoperation | ||
| First week | 23 | 4.63±0.90*# |
| Second week | 33 | 4.81±1.60*# |
| Third week | 20 | 4.56±1.23*# |
*P＜0.01 as compared with the preoperation; #P＞0.05 as compared among the postoperations
表2 术前外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量与抗病毒抗体的关系(%)
Table 2. Relationship between Ag-NORs in T lymphocyte and serum antivirus IgM antibodies level in peripheral blood before transplantation(%)
| Antivirus IgM | Negative(n) | Positive(n) | P value* |
| Anti-CMV |
6.22±0.95(13) |
5.70±0.76(4) |
0.35 |
| Anti-EBV | 6.24±0.93(13) | 5.62±0.18(4) | 0.21 |
| Anti-Cox | 6.16±0.97(12) | 5.95±0.86(5) | 0.69 |
| Anti-ad7 | 6.30±0.91(13) | 5.42±0.62(4) | 0.10 |
| Anti-ad11 | 6.21±0.99( 9) | 5.97±0.88(8) | 0.62 |
| Anti-HSV1 | 6.27±0.96(12) | 5.69±0.75(5) | 0.25 |
| Anti-HSV2 | 6.06±0.97(15) | 6.40±0.03(2) | 0.63 |
*t test between positive and negative antibodies
CMV：Cytomegalovirus；EBV：Epstein Barr virus; Cox：Coxsackievirus; ad7：Type 7 adenovirus; ad11：Type 11 adenovirus; HSV1：Type 1 herpes simplex virus;HSV2：Type 2 herpes simplex virus 5.外周血T淋巴细胞表面抗原的变化与多种抗病毒抗体的关系：所测抗病毒抗体，CMV IgM抗体、Cox病毒IgM抗体和单纯疱疹Ⅰ型IgM抗体阳性者，T淋巴细胞表面抗原CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值等较阴性者均有不同程度的降低；而EB病毒IgM抗体、腺病毒7型IgM抗体、腺病毒11型IgM抗体和单纯疱疹Ⅱ型IgM抗体等阳性者，T淋巴细胞表面抗原CD3、CD4、CD8及CD4/CD8 比值等较阴性有增加也有降低，但统计学分析抗病毒抗体阳性组与阴性组间差异无显著性。
讨论
将核仁组织区（NORs）进行银染可用于反映细胞rDNA的数目或活性，了解银染细胞蛋白质合成速率等功能状态。早在80年代，细胞遗传学家就对NORs进行了深入的研究，主要用于研究遗传缺陷。80年代中期，许多学者将其引入肿瘤研究领域〔1〕，认为通过观察癌细胞Ag-NOR数目、强度、位置和分布可进行肿瘤的病理诊断和分型，并观察到癌前病变的细胞中Ag-NOR也有变化，可进行肿瘤的早期诊断。80年代末期，国内外学者开始研究肿瘤患者外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量的变化〔2〕，发现T淋巴细胞的Ag-NORs在肿瘤患者中表现为低值。可通过检测T淋巴细胞的Ag-NORs含量判断患者机体的免疫状态，并间接推断患者是否患有肿瘤及手术后肿瘤是否复发。
表3 肾移植病人手术前后T细胞表面抗原测定结果
Table 3. Results of T subsets array in renal allograft transplant recipients in the perioperation period
| Monitor time | n | CD3(%) | CD4(%) | CD8(%) | CD4/CD8 |
| Preoperation* |
12 |
46.33±4.88 | 22.58±3.82 | 19.00±1.35 | 1.19±0.17 |
| Postoperation | |||||
| First week* | 13 | 48.38±6.46 | 24.23±2.01 | 19.84±4.14 | 1.22±0.27 |
| Second week* | 17 | 45.41±4.69 | 21.35±5.65 | 19.29±1.65 | 1.11±0.28 |
| Third week* | 7 | 46.16±5.26 | 17.57±3.21 | 16.14±3.80 | 1.11±0.25 |
*P＞0.05 as compared among four monitor times of each subset and CD4/CD8 同种异体肾移植患者在手术后即开始应用免疫抑制剂抑制机体的抗异物反应，以利于移植肾的存活。目前对患者的免疫状态除了临床观察外，实验室观察主要采用T淋巴细胞表面抗原测定和外周血淋巴母细胞转化等实验。上述实验操作繁琐，中间环节多，实验结果受多种人为因素的影响。本组病人为尿毒症患者，其术前外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量在5%～7%之间，说明尿毒症患者可能存在免疫低下。肾移植术后的外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量小于5%，说明术后免疫抑制剂的应用使患者T细胞免疫进一步降低。本组数据显示Ag-NORs含量不受性别的影响，Ag-NORs含量在术后3周内无明显的变化，观察期间无排异反应的发生，说明临床应用的免疫抑制剂维持机体T细胞免疫在一个低的水平，足以保护移植物不受排异。同期检测的T淋巴细胞表面抗原 CD3、CD4、CD4/CD8比值等手术前后、手术后各期之间无显著性变化，说明T淋巴细胞表面抗原测定在免疫低下人群中不如T淋巴细胞Ag-NORs检测敏感。和有关学者〔2〕在肿瘤患者中的测定结论一致。建议使用T淋巴细胞Ag-NORs测定在免疫低下人群中进行免疫监测。
病毒感染对移植物的存活有一定的影响。本实验也观察了外周血T淋巴细胞Ag-NORs含量与体内抗病毒抗体IgM的关系，结果表明两者之间无明显的相关性，提示用T淋巴细胞Ag-NORs含量不能说明机体的体液免疫状态。T淋巴细胞表面抗原测定结果与体内抗病毒抗体IgM也无显著性关系。文献报道〔3〕 ，T亚群在病毒感染期发生变化。本组结果阴性，可能与尿毒症患者免疫低下有关。因此，肾移植患者病毒感染对机体细胞免疫的影响，以及病毒感染对移植物的远期影响，需用其它指标进行检测。
外周血T淋巴细胞核中Ag-NORs测定具有简便、重复性好、准确等优点。因此，在肾移植的病人中检测T淋巴细胞Ag-NORs的变化，对观察肾移植患者免疫功能状态具有一定的意义。
参考文献
1，王瑞年，胡丹毅. Ag-NOR-肿瘤研究的一项新指标(综述). 国外医学肿瘤学分册, 1989, 16:22-26．
2，林其焯, 陈立奇, 吴卫，等. 外周淋巴细胞脱氧核糖核酸核蛋白体转录活性分析. Chin J Med Lab Sci, 1996, 19:220-222．
3，Belles-Isles M, Houde I, Lachance JG, et al．Monitoring of cytomegalovirus infections by the CD8+CD38+ T cell subset in kidney transplant recipients. Transplantation, 1998, 65:279-282．
(收稿日期：1999-09-01)