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Different Nucleotide Sequences of Hepatitis B Virus Clones
within One Patient
Fang Dexing Gan Renbao Li Zaiping Zhai Chunsheng Zhou Zongan(Huadong Research Institute for Medical Biotechnics, Nanjing 210002)
(Shanghai Institute of Biochemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031)
Abstract The HBV HBsAg coding region of a hepatitis B patient was analyzed by PCR amplification, bacteriophage cloning and nucleotide sequencing. It was showed that among different clones from the same patient there were point mutations and these different nucleotide changes were not resulted from the methodologies. It is concluded that there are polymorphic HBV genomes within the same hepatitis B patient.
Key words Hepatitis B virus, S gene, Nucleotide sequencing, Point mutation, Polymorphism
乙型肝炎病毒属于DNA病毒，但其复制中有一个反转录过程，这一特点决定了其基因组的高突变率。据估计，嗜肝DNA病毒体内突变率近于2×10-4/位．年[1]，这比RNA病毒低1～2个数量级，但比一般的DNA病毒高4个数量级[2]。Okamoto等(1987)对一个54岁乙型肝炎患者体内HBV进行突变分析表明，假如病毒来自出生时感染的同一母源毒株，则在其体内突变率为1.4×10-5～3.2×10-5/位．年[3]。分析已发表的HBV全基因组或部分基因序列可以看出，即使同一亚型也有很大差异，而其中来自中国人的序列数目极少，建立中国人不同亚型HBV基因库对于正确指导HBV变异研究工作极其重要[4]。
我们在研究HBV表面抗原变异中曾经发现不同于国外报道的新型变异株[5～8]，并分别发表了其HBsAg编码区的全序列(GenBank Accession Number AF013629，AF013630，AF013631)。本文报道了从免疫失败儿童体内分离到的另一个HBV变异株的HBsAg编码区的全序列和部分前S2序列以及该患者体内HBV基因组可能存在的多态性。
1 材料与方法
1.1 血清样本及PCR扩增的HBV S基因片段 患者24号(No.24)的血清学资料及HBV S基因片段的PCR扩增结果见参考文献[7]。简要地说，该患儿注射过乙型肝炎疫苗，但抗HBs抗体阴性，经PCR扩增从其血清中获得HBV全长S基因。基因位置相当于HBV基因组nt2826～nt839，长约1.2kb。该片段5′端设计有BamHI酶切位点，3′端有PstI酶切位点。
1.2 分子生物学工具酶和试剂(盒) BamHI、PstI、XbaI、T4 DNA连接酶和Tag DNA聚合酶购自Promega公司；T7 DNA序列分析试剂盒购自Pharmacia公司；SILVER SEQUENCE DNA序列分析试剂盒购自Promega公司。
1.3 DNA克隆和核苷酸序列分析 DNA克隆与鉴定方法参考文献[8]。DNA序列分析方法采用双脱氧终止法，按照DNA序列分析试剂盒操作手册进行。
2 结果
2.1 含HBV全长S基因片段重组噬菌体的筛选 将PCR扩增的1.2kb DNA片段以BamHI-PstI双酶切后，与经同样双酶切的M13mp18 RF DNA载体片段相连接；用此连接物转化E.coli TG1感受态菌，在含X-gal和IPTG的半固体LB培养平皿中培养，随机挑取10个白色噬菌斑培养后，按常规方法抽提噬菌体RF DNA。经BamHI-PstI双酶切，有8个含有插入片段(约1.2kb)，见图1所示。
图1 重组噬菌体的限制性酶切鉴定结果
Fig.1 Characterization of recombinantbacteriophage by restriction digestion
2.2 核苷酸序列分析结果 分别培养重组噬菌体2401、2402、2409和2410，按常规方法抽提单链重组噬菌体DNA，以pUC/M13通用引物(序列为5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG-AC-3′)和P4(5′-GAAGATGAGGCATAGCAG-3′，HBV基因组特异性序列，nt433～nt416，反向引物)为引物进行核苷酸序列分析。4个克隆的HBsAg编码区全序列及部分前S2序列如图2所示。根据已有的资料结合上述核苷酸序列分析结果，可见该患者感染的HBV属于adr亚型(nt364～nt366为Arg密码子AGA，nt478～nt480为Lys密码子AAG)。同时值得注意的有以下两点：(1) 在HBsAg编码区nt376～nt378位为Thr密码子ACT，这与已知的所有adr亚型HBV不同；(2) 不同克隆间存在碱基差异，表1列出了4个克隆相差碱基及位置。
图2 由4个重组噬菌体克隆测定的HBsAg编码区及部分前S2区序列的比较分析
Fig.2 Comparison of the HBsAg coding region and partial pre-S2 region from 4
different recombinant bacteriophage clones
表1 4个不同重组噬菌体克隆中HBV基因序列相差碱基及位置
Table 1 Different bases and position among four recombinant bacteriophage
clones of HBV S gene
| 克隆 Clones | 碱基及其位置 Bases and position | ||||||||
| 7 | 8 | 17 | 42 | 44 | 313 | 327 | 616 | 728 | |
| 2401 | A | A | C | G | G | C | A | C | |
| 2402 | A | G | G | C | C | ||||
| 2409 | A | C | G | C | A | ||||
| 2410 | A | A | C | G | G | G | A | C | |
2.3 单基因组的扩增、克隆和核苷酸序列分析 鉴于在同一患者体内检测到不同的HBV DNA序列，为了排除方法学所产生突变的可能性，对本实验室所克隆的已知adr亚型HBV DNA (pADR-1)[9]，按同样方法进行PCR、M13噬菌体克隆和核苷酸序列分析。结果在随机挑取的3个重组噬菌体克隆中HBV DNA序列完全相同，并与预期的相符合(结果未列出)。3 讨论
众所周知，HBsAg有一个共同的属特异性抗原决定簇a和至少两种型决定簇d/y和r/w，由此决定了HBV的4个主要血清学亚型：adr、adw、ayr和ayw。对于这些血清学亚型的核苷酸位点，已有过较为详细的研究，aa122和aa160位是分别决定d/y和r/w的关键位点。关于aa126位点实际存在的差异，似乎一直未加重视。直到1990年Ohnuma等报道了对该位点不同的HBsAg的研究结果，并提出第三对等位基因亚型决定簇(i/t)的概念，即aa126位Ile为i亚型，aa126位Thr为t亚型，人们才开始认识到这一位点在血清学分型中的重要性[10]。由于迄今已发表的所有adr亚型HBV在该位均为Ile密码子ATT，No.24患者感染的HBV显然是一个adri→adrt变异株。我们在进行HBV表面抗原变异的系列研究工作中曾发现一个aa126位由Ile变为Ser的免疫逃避变异株[7]。鉴于在adw/ayw亚型的aa126位存在Thr(ACT)，No.24 adri→adrt变异株与临床免疫学的关系尚待进一步研究。
从表1可以看出4个重组噬菌体克隆间有9个位置存在碱基差异。由于在实验中采用了PCR扩增和M13噬菌体克隆方法，两者都是可能产生突变的因素。然而这些方法学上的突变在理论上不可能大到在小样本(小于10)随机抽样中可以检测到的水平，尤其是nt42位2个克隆(2402和2409)为C，另外2个克隆(2401和2410)为G，因此这种同一患者体内检测到的不同HBV基因序列显然反映了HBV基因组的多态性。对单一克隆HBV DNA进行的实验结果表明，在小样本挑选时，不同克隆间序列完全一致，排除了本研究中方法学产生突变的可能性，进一步肯定了该患者体内HBV DNA序列的不均一性。事实上在对另一例患者No.19感染的HBV S基因进行的核苷酸序列分析中，也同样发现这种多态性。该患者感染的是一个HBsAg aa126 Ile→Ser变异株[7]，在同时测定3个克隆后，发现有3个位置存在碱基差异，分别为nt13(1901T，1903T，1904C)、nt36(1901C,1903T,1904C)和nt143(1901A,1903G,1904A)。
基于PCR的HBV DNA突变分析中，为了排除方法学上产生的“突变”，得到患者所感染HBV的“真实”序列，可考虑两种方案。其一，直接对PCR产物进行序列分析；其二，先将PCR产物克隆(通常采用M13噬菌体克隆方法以获取单链重组DNA)，然后分别对多个克隆进行序列分析。本研究表明，PCR扩增-克隆-序列分析方法学本身(即使产生了突变也)不会将突变反映在实验结果中。因此，通过克隆得到的核苷酸序列是患者体内存在的HBV“真实”序列，根据对多个克隆的序列分析结果可以推断患者感染的HBV源毒株(序列)。
参考文献
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[2] Liang TJ, Blum HE, Wands JR. Characterization and biological properties of a hepatitis B virus isolated from a patient without hepatitis B virus serologic markers. Hepatology, 1990,12:204～212
[3] Okamoto H, Imai M, Kametani M et al. Genomic heterogeneity of hepatitis B virus in a 54-year-old woman who contracted the infection through maternofetal transmission. Jpn J Exp Med, 1987,57:231～236
[4] 候金林，梁炽森，骆抗先. 乙型肝炎病毒S基因“a”决定簇基因序列的多态性. 中华微生物学和免疫学杂志，1996，16：1～4
[5] 倪方锷，甘人宝，杜传书等. 一个表面抗原144位Asp→Ala新乙型肝炎变异株.病毒学报，1994，10：57～62
[6] Ni F, Fang D, Gan R et al. A new immune escape mutant of hepatitis B virus with an Asp to Ala substitution in aa144 of the envelope major protein. Res Virol, 1995,146: 397～407
[7] 房德兴，甘人宝，李载平等. 乙型肝炎病毒的表面抗原126位Ile→Ser变异株. 生物化学和生物物理学报，1996，28：429～433
[8] 房德兴，甘人宝，张倩等. 乙型肝炎病毒表面抗原126位Ile→Ser变异株HBsAg的暂时表达和抗原性鉴定. 病毒学报，1998，14(1)：1～9
[9] 甘人宝，储美瑾，沈绿萍等. 克隆的adr亚型乙型肝炎病毒(pADR-1) DNA的全顺序. 中国科学(B辑)，1986，1：55～65
[10] Ohnuma H, Takai E, Machida A et al. Synthetic oligopeptides bearing a common or subtypic determinant of hepatitis B surface antigen. J Immunol, 1990,145:2265～2271