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Isolation, Identification and Biological Properties
of Ten-Strain Variclla-Zoster Viruses
Zheng Guanzeng Ye Donggui Zhu Zhiyong
(Taizhou City Sanitary and Epidemic Prevention Station, Taizhou, Zhejiang Province 317000)
Abstract Ten strains of virus were isolated from vesicle fluid of skin lesions of 12 patients with variclla or herpes zoster by means of Vero-E6 cells. The postive rate was 83.3%. These viruses all cause typical cell damages such as rounded and shrivelled, fusion and fallout. These damages got quick following increased future degenerations. The typical fluorescence lump of nucleus within the infected cells would be found by indirect immunofluorescence technique. The antigen samples prepared with virus-infected cells could be used to examine the sera of patients with herpes zoster and it could be found that the antibody titer in recovering stage was four times as much as that in acute stage. VZV was sensitive to Vero cells and not sensitive to the primary simple-lager cells from Meriones unguiculatus kidney, fetal rabbit kidney and fetal guinea pig kidney, lung and spleen. VZV was insensitive to newborn white mouse too. The viruses would die within one week at -20 ℃, but they can be preserved in Eagle's solution containing de-fat milk, newborn bovine serum and sorbitol at -100 ℃ over two years.
Key words Variclla-zoster viruses, Isolation, Identification, Biological property
水痘带状疱疹病毒(VZV)是引起人类水痘、带状疱疹的病原。为了寻找水痘带状疱疹疫苗病毒株及研制疫苗的基质细胞，我们自1994年以来，用Vero-E6细胞床边接种法，从2例水痘和10例带状疱疹病人水疱液中分离到10株VZV，并对其生物学特性作了初步探索研究。现报告如下：
1 材料与方法
1.1 标本 12例标本均用无菌注射器吸取病人出疱后2～10?d的水疱液，立即送病毒实验室接种。
1.2 细胞 Vero-E6及Vero传代细胞由朱智勇教授提供；2BS和HLF二倍体细胞分别来自中国药品生物制品检定所和中科院上海细胞所，本室传代保存；沙鼠肾，胎兔肾，胎豚鼠肾、肺、脾原代细胞均本室自制。生长液为10%新生小牛血清Eagle’s液。
1.3 病毒分离[1] 生长成单层的Vero-E6细胞倒去生长液，每5mL小方瓶单层细胞接种标本0.1～0.5mL(视标本量而定)，36℃吸附2h后，倒去标本液，用Eagle’s液洗一次，加5mL维持液，置36℃温箱每日观察CPE。每隔2～3d换液一次，7d后如无CPE出现则进行盲传，盲传3次仍无CPE则视为分离阴性。
1.4 带状疱疹病人急性期及恢复期双份血清 急性期血清采自病人出疱第1～2天，恢复期血清采自出疱后10～14?d皮损结痂大部分脱落的病人血清。
1.5 间接免疫荧光测定[2] 出现CPE后的细胞，用0.02% EDTA+0.1%胰酶消化液分散细胞，取小量细胞悬液滴在玻片上干燥，冷丙酮固定10?min后，1∶20稀释带状疱疹恢复期病人血清37℃结合45?min,洗涤、吹干后加甘油封片，用荧光显微镜观察细胞核内荧光染色情况。
1.6 CPE观察 接种标本后，每天观察对照细胞有无自然脱落等非特异性细胞死亡现象及VZV特异性CPE。“＋”示CPE在25%以下，“
1.7 VZV某些生物学特性的研究 VZV1经Vero细胞连续3次带毒传代，CPE达“
2 结果
2.1 病毒分离情况
用Vero-E6细胞从12例水痘或带状疱疹病人疱液中分离到10株病毒，阳性率为83.3%。其中男6例，女4例。水痘病人1例，带状疱疹病人9例。病人年龄在5～72岁，平均31.2岁。标本采集时间在出疱后2～10d，平均5.4d。8份标本在接种细胞3～8d(平均6d)出现“＋～
表1 标本来源及病毒分离情况
Table 1 Source of sample and isolation of virus
| 标 本 来 源
Source of sample |
CPE出现情况
Appearance of CPE |
毒株编号
Strain No | |||||
| 患者
Case |
性别
Sex |
年龄(岁)
Age(Years) |
采样距出疱天数
Days from sampling to vesicle |
临床诊断
Clinical diagnosis |
原代细胞
Primary cells |
次代细胞
Secondary cells | |
| 泮×× | M | 5 | 2 | Varicella | VZV1 | ||
| 胡×× | M | 10 | 3 | Herpes zoster | ＋ | VZV2 | |
| 何×× | F | 22 | 10 | Herpes zoster | ＋ | VZV3 | |
| 张×× | M | 21 | 6 | Herpes zoster | ＋ | VZV4 | |
| 张×× | F | 23 | 4 | Herpes zoster | VZV5 | ||
| 尹×× | M | 72 | 5 | Herpes zoster | ＋ | VZV6 | |
| 孙×× | M | 25 | 8 | Herpes zoster | ＋ | VZV7 | |
| 陈×× | F | 50 | 6 | Herpes zoster | ＋ | VZV8 | |
| 陈×× | F | 8 | 4 | Herpes zoster | VZV9 | ||
| 叶×× | M | 66 | 6 | Herpes zoster | ＋ | VZV10 | |
2.2 CPE特点细胞开始表现为肿胀、圆缩、聚集，最后出现多个细胞融合、脱落，如图1、图2。
图1 VZV致Vero-E6细胞圆缩、融合、脱落病变(放大400倍)
Fig.1 VZV causes typical Vero-E6 cell damages such as
rounded and shrivelled, fusion and fallout (×400)
图2 VZV致Vero-E6细胞圆缩、融合病变(放大100倍)
Fig.2 VZV causes typical Vero-E6 cell damages such as
rounded and shrivelled as well as fusion (×100)
2.3 感染细胞间接免疫荧光染色特点
经间接免疫荧光染色镜检，可见感染细胞内典型的核内荧光块，充满整个细胞核，细胞浆内无任何荧光颗粒，如图3。
3 VZV感染细胞核内荧光抗原
Fig.3 Antigen of fluorescence in VZV-infected cell nucleus
2.4 病人双份血清间接免疫荧光抗体滴度
将出现CPE“
表2 带状疱疹病人双份血清免疫荧光抗体滴度
Table 2 Titer of immunofluorescence antibody of sera of acute and recovering stage of patients with herpes zoster
| 毒株号
Strain No. |
血 清 抗 体 滴 度 倒 数
Reciprocal antibody titer of sera | ||||
| 1号血清
Serum 1 |
2号血清
Serum 2 |
3号血清
Serum 3 |
4号血清
Serum 4 |
5号血清
Serum 5 | |
| VZV1 | ＜20 | 80 | 20 | 20 | 20 |
| 1280 | 1280 | 640 | 640 | 1280 | |
| VZV2 | ＜20 | 20 | 20 | 80 | 20 |
| 1280 | 320 | 320 | 1280 | 640 | |
| VZV3 | ＜20 | 80 | 20 | 80 | ＜20 |
| 1280 | 1280 | 640 | 1280 | 640 | |
| VZV4 | ＜20 | 80 | 80 | 20 | 20 |
| 640 | 640 | 1280 | 640 | 1280 | |
| VZV5 | ＜20 | 20 | 20 | 80 | ＜20 |
| 640 | 640 | 320 | 1280 | 320 | |
| VZV6 | ＜20 | 20 | 20 | 80 | 20 |
| 1280 | 1280 | 640 | 640 | 640 | |
| VZV7 | ＜20 | 80 | 20 | 80 | 20 |
| 1280 | 640 | 1280 | 1280 | 640 | |
| VZV8 | ＜20 | 20 | 20 | 80 | ＜20 |
| 1280 | 640 | 1280 | 640 | 320 | |
| VZV9 | ＜20 | 20 | 80 | 20 | 20 |
| 640 | 640 | 1280 | 640 | 1280 | |
| VZV10 | ＜20 | 80 | 20 | 20 | 20 |
| 1280 | 1280 | 1280 | 640 | 640 | |
*：上排为急性期血清，下排为恢复期血清。
The above is acute stage sera, the underneath is recovering stage sera.2.5 VZV部分生物学特性的研究
2.5.1 VZV1在传代细胞、二倍体细胞及原代细胞上适应情况 将VZV1毒种接种于Vero-E6，Vero传代细胞，2BS和HLF二倍体细胞，沙鼠肾原代细胞，胎兔肾原代细胞，胎豚鼠肾、肺、脾原代单层细胞。结果Vero及Vero-E6传代细胞接种5～7d后出现典型的VZV CPE；2BS、HLF及其它原代细胞经盲传三代未见CPE，括取细胞做荧光染色也未见阳性细胞。
2.5.2 VZV1在Vero细胞内生长后的TCID50 VZV1在Vero细胞上传至CPE达“
2.5.3 VZV1在Vero细胞上的生长特点
2.5.3.1 VZV1毒种接种Vero单层细胞后，第5天开始出现CPE“＋”；带毒传代后，第3天为“
2.5.3.2 将盖玻片放入细胞瓶内，培养成单层细胞后，接种毒种，待出现典型的CPE后，取出盖玻片作荧光染色镜检，结果荧光阳性细胞仅出现在有CPE的细胞核内。
2.5.4 VZV1在乳长爪沙鼠，乳小白鼠中适应情况 分别将2日龄乳长爪沙鼠(8只)，乳小白鼠(7只)，每只脑内接种毒种0.02mL，腹腔接种0.5mL，第5天开始逐日观察其发病情况，并每天取1只鼠脑、肺、脾、肾冰冻切片，间接免疫荧光法动态检查VZV抗原；结果试验组乳鼠均未发病，也未检测到阳性抗原。
2.5.5 VZV细胞培养上清液病毒感染性测定 4株VZV分别接种Vero细胞，待CPE达“
2.5.6 VZV毒种保存 5株毒种分别接种Vero细胞，CPE达“
3 讨论
3.1 一些学者认为VZV最敏感的培养细胞是人胚肺纤维母细胞、羊膜细胞。本研究用Vero-E6细胞分离VZV，病毒分离阳性率高达83.3%。其原因可能与以下几个因素有关： 一是VZV对Vero-E6细胞比其它细胞敏感；二是采用床边接种法，标本未经冷冻保存，病毒滴度高，感染力强。2例标本未分离到病毒主要原因是所取水疱液量太少，且病人用过干扰素、病毒唑、阿昔洛韦等抗病毒药物。
3.2 本次分离到的10株病毒，8株在标本接种后的第一代就出现典型的VZV CPE，全部病毒株经3次细胞带毒传代后出现“”CPE。感染细胞制成抗原片，用5例带状疱疹病人双份血清检查，恢复期比急性期抗体滴度均有4倍以上增加。荧光染色可见感染细胞具典型的核内荧光抗原，细胞浆内无任何荧光颗粒。上述检测结果均符合VZV典型特征[1～4]。结合临床诊断，我们认为本次分离到10株病毒确系水痘带状疱疹病毒。
3.3 VZV1等毒株部分生物学特性研究结果有如下特点：
(1) VZV对Vero及Vero-E6细胞高度敏感，是分离及研究VZV的首选细胞株。
(2) VZV在2BS和HLF二倍体细胞上难以适应；VZV对胎兔肾，乳长爪沙鼠肾，胎豚鼠肾、肺、脾原代细胞不敏感；VZV对乳长爪沙鼠、乳小白鼠亦不敏感。
(3) 从CPE及盖玻片小培养荧光染色特点分析，VZV产生明显的局灶性细胞病变；病毒在细胞核内增殖；细胞病变随着传代次数增加而加快。
(4) VZV在Vero细胞内增殖后，病毒TCID50滴度是10-2～10-3，明显低于流行性出血热、脊髓灰质炎等病毒[6，7]。
(5) VZV感染细胞上清液接种细胞，经盲传一代后，出现CPE，说明病毒在细胞核内增殖的同时，有感染性病毒颗粒释放到液体中。
(6) VZV病毒在含30%脱脂牛奶、20%小牛血清、10%山梨醇的Eagle’s液体或经真空冷冻干燥后-100?℃能保存二年以上。
参考文献
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