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Detection of serum hepatitis B virus DNA in patients with various chronic liver diseases Zhou Zicheng, Liu Chongyang,Yang Jianmin.Department of Gastroenterology,Southwest Hospital,Third Military Medical College, Chongqing 630038
Abstract With established competitive ploymerase chain reaction (PCR)method,serum HBV DNA concentration was determined in 125 patients with primary hepatic carcinoma(n＝38)，liver cirrhosis (n＝36)and chronic hepatitis (n＝51)with different serum HBV immunological markers .The results showed that:(1) No significant variation of HBV DNA concentration was detected in patients with different chronic liver diseases; (2)About one third of the examined patients whose five serum HBV markers were negative and anti-HBs were positive showed low level of viral replications; (3)The total concentration of HBV DNA in the patients with positive HBeAg were significantly higher than that in patieats positive for anti-HBe,but also found a high HBV DNA concentration in some of the latter .It suggess that the manner of viral replication were not correlated with the period of the chronic liver disease.So HBV replicative status may not be completely determined only by seroconvertion of HBeAg to anti-HBe.
Key words: Polymerase chain reaction Hepatitis B virus Hepatitis DNA, viral
1996年5月10日收稿 1997年9月1日修回
乙型肝炎病毒(HBV)感染后的临床表现形式十分复杂，不同个体、不同病期均可出现截然不同的临床表现，仅常用的HBV五项免疫标志，表现模式就有15种以上，其内在原因至今仍不十分清楚。近年随着聚合酶链反应(PCR)技术的大力推广与普及，作为一项实验诊断技术已开始进入临床。随之而来的一个问题，是一些“健康”人体中也可检出微量HBV DNA。有人提出这种仅根据病原存在与否的定性PCR尚难以明确其临床意义［1］。如能应用定量PCR技术来确定病态时特异病原体基因水平的界线值则可能会有很大帮助。为此，我们应用自行建立的竞争性PCR方法定量检测不同慢性肝病血清中的HBV DNA浓度，以探讨其临床意义。
1 材料和方法
1.1 血清标本 选择第三军医大学西南医院1993～1994年住院的不同类型慢性肝病患者125例，其中慢性肝炎(CH)51例，男39例，女12例，平均年龄35.1(18～54)岁；肝硬化(LC)36例，男24例，女12例，平均年龄45.2(23～70)岁；原发性肝癌(PHC)38例，男34例，女4例，平均年龄49.3(31～74)岁。全部病例的诊断均符合1990年《病毒性肝炎防治方案》和1991年全国原发性肝癌诊疗规范中的诊断标准。血清采用经高压灭菌的1.5ml新Eppendorf管分装，于-20℃冻存待检。
1.2 血清HBV DNA定量检测方法 采用自行以计算机设计，由中科院上海细胞所合成的HBV S基因保守区的三条引物：正链引物a22、负链引物b21及负链缺失引物b15c21。首先用引物a22和b15c21以PCR方法制备出缺失序列，后者经纯化、定量后作为竞争模板。然后用引物a22、c21及已知量的竞争膜板与待测DNA样品进行共扩增。来自竞争模板与靶基因的扩增产物，因序列长度不同(前者要短120bp)可通过电泳加以区分。比较两产物的相对量变化即可将所测样品进行定量。
1.3 血清HBV五项免疫标志的检测 采用上海科华公司EIA试剂盒。
1.4 统计方法 采用第三军医大学数理教研室编制的医用统计程序包(SPMR)。
2 结果
2.1 不同慢性肝病患者血清HBV DNA的检出率 表1显示HBsAg与HBeAg均阳性组，HBV DNA检出率显著高于HBsAg与抗-HBe均阳性组(P＜0.05)；抗-HBs阳性组与五项标志全阴性组间的检出率无明显差别，但均非常显著低于HBsAg阳性的两组(P＜0.01)。不同类型的慢性肝病组间比较则检出率均无显著差异(P＞0.05)。
2.2 不同慢性肝病患者血清HBV DNA浓度 双因素方差分析结果表明，血清HBV DNA浓度水平与免疫学标志物有非常显著的相依关系(P＜0.01)，而与慢性肝病类型则无显著相依关系(P＞0.05)，免疫标志与慢性肝病类型两因素对血清HBV DNA浓度无交互影响。比较不同免疫状态下血清HBV DNA浓度发现，HBsAg与HBeAg均阳性组的血清HBV DNA浓度明显高于HBsAg与抗-HBe均阳性组(P＜0.05)。而HBsAg阳性的两组，血清HBV DNA浓度显著高于抗-HBs阳性组和五项标志全阴性组(P＜0.05)，但抗-HBs阳性组与五项标志全阴性组血清HBV DNA浓度水平无显著性差异(P＞0.05)。
表 1 125例不同慢性肝病患者血清HBV DNA的检出率
Tab.1 Detection rate of serum HBV DNA concentration in 125 patients with chronic liver diseases
| 临床类型
Clinical type |
血清HBV免疫标志
Serum HBV immunological markers |
合计
Total No.(%) | |||
| HBsAg*+ | HBsAg#+ | 五项标志全阴性 | |||
| HBeAg+ | Anti-HBe+ | Anti-HBs+ | HBV five
markers negative | ||
| CH | 16/17 | 10/13 | 3/10 | 4/11 | 33/51(64.7) |
| LC | 9/9 | 8/10 | 3/8 | 4/9 | 24/36(66.7) |
| PHC | 10/10 | 8/10 | 3/6 | 4/12 | 25/38(65.8) |
| 合计
Total |
35/36(97.2%) | 26/33(78.8%) | 9/24(37.5%) | 12/32(37.5%) | 82/125(65.8%) |
*部分病例同时伴抗-HBc(+)，为简化起见未分。 #接种过乙肝疫苗者除外
*Part of patients were Anti-HBc positive #Subjects inoculated with HBV vaccine were ruled out
表 2 82例HBV DNA阳性肝病患者血清HBV DNA浓度的对数均值(log10 HBV DNA拷贝/50μl)
Tab.2 Mean value of logarithm of serum HBV DNA concentration in 82 liver disease patients with HBV DNA positive (log10 HBV DNA copy/50μl)
| 临床类型
Clinical type |
血清HBV免疫标志
Serum HBV immunological markers |
||||
| HBsAg+
HBsAg+ |
HBeAg+
Anti- HBe+ |
Anti-
HBs+ |
五项标志
全阴性 HBV five markers negative | ||
| CH | 5.84 | 4.6 | 3.25 | 3.75 | 4.36 |
| LC | 6 | 4.8 | 3.33 | 4 | 4.55 |
| PHC | 5.7 | 5 | 3 | 4 | 4.43 |
| 5.85 | 4.77 | 3.21 | 3.86 | ||
3 讨论
3.1 关于不同慢性肝病患者间血清HBV DNA的比较 本研究资料显示，慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌三组在血清HBV DNA检出率及阳性患者血清HBV DNA浓度水平上均无显著性差异(P＞0.05)。说明HBV的复制状态在不同类型慢性肝病间无明显差异，病毒复制是否活跃与不同类型慢性肝病的病期无明显内在关系。国外有研究发现，原发性肝癌和肝硬化患者的血清HCV rNA水平显著高于慢性迁延性肝炎，因而提出HCV感染后的病情进展可能与复制的病毒浓度有关［2，3］。但这与本文在HBV感染的研究结果不同，这种差异的原因尚不清楚，有待进一步研究。
3.2 关于HBV五项免疫标志全阴性肝病患者血清HBV DNA的检测在HBV五项免疫标志均阴性的慢性肝病患者中可检出HBV dNA已为许多学者的研究所证实［4］。骆抗先等［5］报道，15例HBV 免疫标志均阴性的慢性活动性肝炎患者中有9例HBV dNA阳性，阳性率高达60%。本组32例HBV免疫标志均阴性的慢性肝病患者中有12例阳性，占37.5%。关于这些免疫标志均阴性的原因，有人推测可能与体内病毒的数量、核酸序列的变异及宿主的免疫状态有关［6］。另外由于Elisa法敏感性有限，可能造成低滴度的标志物漏检。本组资料五项标志阴性慢性肝病血清HBV dNA浓度为103-105拷贝/50μl，平均为103.86拷贝/50μl，显著低于HBsAg阳性组，表明体内病毒数量少可能是导致HBV标志物阴性的一个主要原因。
3.3 关于抗-HBs阳性患者血清HBV DNA的检测 一般认为，抗-HBs是一种中和抗体，因而常将其作为机体获得免疫力及乙型肝炎患者痊愈的重要标志［7］。但近来的研究发现抗-HBs阳转者仍可携带HBV［8～9］。本文24例抗-HBs阳性的慢性肝病患者中有9例HBV dNA阳性(37.5%)，提示抗-HBs阳转并不意味着体内HBV 的完全清除。定量PCR发现，抗-HBs阳性HBV DNA阳性病例的血清HBV DNA浓度为103-104拷贝/50μl，说明这些病例仍存在低水平病毒复制。
3.4 关于HBsAg/HBeAg均阳性与HBsAg/抗-HBe均阳性组的比较 传统的观点认为HBeAg是HBV复制活跃及传染性强的指标，而抗-HBe意义基本与HBeAg相反，它的出现表明病毒复制减少，传染性减弱。Scotto等采用斑点杂交法分析HBV dNA，发现大多数HBeAg阳性患者存在高水平的HBV复制［10，11］，而在抗-HBe阳性组中仅能在18%-40%的患者检测到HBV dNA［12，13］。本研究HBsAg阳性组HBV DNA的检出率为97.2%，HBV DNA浓度均值为105.85拷贝/50μl，均明显高于抗-HBe阳性组的78.8%和104.77拷贝/50μl，支持前述观点。但考察个体时可以发现，抗-HBe阳性组中有部分病例的HBV dNA浓度高于HBeAg阳性组的均值。提示该组存在个体差异，不能仅根据抗-HBe阳转与否来判断病毒复制状态。
参 考 文 献
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4 余竹元，汤剑猷，周铭，等 .聚合酶链反应检测血清中HBV DNA 的临床意义.上海医科大学学报，1993，20：11-15.
5 骆抗先，周荣，梁炽森，等.聚合酶链反应鉴定HBsAg阴性慢性活动性肝炎中乙型肝炎病毒感染.中华内科杂志，1991，30：21-23.
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7 Caselman W H,Eisenburg J,Hofschneider P H, et al.Beta and gamma interferomi chronic active hepatitis B.A pilot trial of short-term combination therapy.Gastroenterology,1989,96:449-455.
8 Kaneko S,Miller R H,Eeinstome S M,et al.Detection of serum hepatitis B virus DNA in patients with chronic hepatitis using the polymerase chain reaction assay.Proc Natl Acad Scj. USA,1989,36:312-316.
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10 Scotto J,Hadchouel M,Hery C,et al.Detection of hepatitis B virus DNA in serum by a single spot hybridization technique : comparison with results for other viral markers.Hepatology,1983,3:279-284.
11 Lieberman H,Labreque D,Kew M,et al.Detection of hepatitis B virus directly test:comparison to HBeAg/anti-HBe status.Hepatology,1983,3:385-391.
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13 Baker B L,Dibisccglie A M,Kaneko S,et al.Determination of heptitis B virus DNA in serum using the polymerase chain reaction: Clinical significance and correlation with biochemical and serological markers.Hepatology,1991,13:632-636.