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YY1 and its repressive effect on human papillomavirus 16 early promoter P97 exist ed widely among human epithelial cell lines Dong Xiaooping,Liu Hong,Herbert Pfister.Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100052
Abstract Cellular transcription factor YY1 represses the activity of early promoter P97 of HPV 16.Removal of the specific binding sites for YY1 in HPV 16 LCR can increase the P97 activity.To analyse the expression of YY1 and the existence of the activation effect on P97 due to removing YY1 binding sites inthe LCR region,we extracted nuclear proteins from four cervical cancer cell lines and two human keratinocytes.EMSA assays were carried out in vitro.At the same time, we transiently transfected the luciferase reporter plasmids,which contain HPV 16 reference and mutated LCR sequences,respectively,into the different cells and determined the luciferase expressions.The results showed that all the analysed cell lines contained biologically functiona1 YY1 proteins.No remarkable difference in the concentration of native YY1 proteins could be detected among the tested cells.Removal of YY1 binding sites in HPV 16 LCR could elevate P97 activity in several analysed celll lines,including normal human primary keratinocytes from foreskin.lt suggests that YY1 regulatory system exists widely in human epithelial cell lines. We also found that the transcription activator NF1 was more highly expressed in C33a cell than in HT3 cell,indicating an unevenly distribution of functional proteins in various cell lines.
Key words: YY1 Human papillomavirus P97 NF1
细胞转录调节因子YY1属GLI-Klueppel蛋白，在多种细胞和病毒启动子调节区域都有其特异性结合位点。根据启动子结构的不同YY1蛋白可激活或抑制启动子的活性。YY1可抑制腺病毒P5启动子的活性，而其抑制作用可被腺病毒早期蛋白E1A逆转〔1〕。YY1可抑制Epstein-Barr(EB)病毒BZLF-1启动子活性〔2〕并对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)的转录和病毒装配起负性调节作用〔3〕。YY1可增强单纯疱疹病毒1型结构蛋白启动子活性〔4〕。此外YY1与SP1蛋白协同可诱导腺病毒P5启动子转 录起始〔5〕。
在人乳头瘤病毒16型(Humanpapilloma-virus type16,HPV16)长控制区(Long control region, LCR)上存在有多个YY1结合位点。YY1蛋白通过结合至相应位点抑制早期启动子P97活性〔6～8〕。YY1位点的突变及缺失可在宫颈癌细胞系HT3中诱导3.5～6.7倍的P97活性增强。为了进一步观测在其它HPV易感细胞系中YY1的表达及YY1位点破坏引起的P97活性增强效应的存在情况，我们提取了6种人类上皮细胞核蛋白进行内源性YY1的检测，同时进行P97活性的测定。
1 材料和方法
1.1 质粒 所用荧光素酶表达质粒为pA-luc〔6〕。pH16-luc带有HPV 16 原毒株LCR序列(nt 7 004-123)。pT390-luc为相同长度的HPV 16 LCR 序列含有一nt7796位G→A的突变，该突变破坏了一个启动子远端YY1位点(nt 7 791-7799)的YY1蛋白结合能力。pT1326-luc带有一115 bp的缺失突变，除去了两个YY1结合位点〔6〕
1.2 HIS-YY1的纯化 HIS-YY1融合蛋白表达质粒pHIS-YY1系Dr.T.Shenk惠赠〔1〕。将带有pHIS-YY1质粒的大肠杆菌E.coli RR菌株活化培养至吸光度A值(600nm)约0.4时，加1μmol/L IPTG诱导蛋白表达。4℃离心收集细菌，以呱嘧啶-盐酸法裂解〔6〕。裂解物变性后经NTA＋-agarose亲和层析柱分离纯化。洗脱液复性后经SDS-PAGE电泳，EMSA鉴定，-80℃保存。
1.3 细胞培养及转染 子宫颈癌细胞系HT3，HeLa,C33a及SiHa细胞，人角源细胞HaCat在含10%的小牛血清的DMEM培养液中生长。人原代包皮角源细胞(Human primary keratinocyte from foreskin,HKfF)在无血清角源细胞培养液(PromoCell公司产品)中生长。对HT3，HeLa,C33a，及HaCat细胞转染采用磷酸钙法〔7〕，2μg质粒DNA，0.5μg pRSV-β-gal DNA同250mmol/L CaCl2，1×HBS缓冲液(280mmol/L NaCl,10mmol/L KCl,1.5 mmol/L Na2HPO4,50mmol/L HEPES)室温作用20分钟。对SiHa和HKfF细胞转染采用LipofectAMINE法，2μg质粒DNA，0.5μg pRSV-β-gal DNA同10μl LipofectAMINE(Gibco公司产品)室温作用30分钟。将作用后的DNA滴加至60mm约70～80%生长丰度的单层细胞培养皿中，次日PBS洗后换液。转染48小时后收集细胞，经4次反复冻溶，离心收集上清。
1.4 胞核提取物的制备 收集生长丰度95%左右的单层培养细胞(100mm培养皿)，PBS洗两次。加1ml胞核裂解液〔7〕冰浴30分钟，离心收集沉淀之细胞核。加0.1ml胞核蛋白洗脱液〔7〕冰浴1小时。15 000r/min,4℃离心30分钟收集上清。蛋白定量(BIO-RAD公司蛋白定量试剂)后-80℃保存。
1.5 EMSA 所用双链寡核苷酸片段Oligo-WT为HPV 16 LCR(nt.7836-7875)序列，其中带有一个启动子近端YY1结合位点(nt 7840-7848)〔6〕。Oligo-PM为相同的HPV 16 LCR序列含有一nt7843位的A→G突变〔6〕。Oligo-NF为HPV 16 LCR序列(5’-CCTAATTGCATATTTGGCATAAGG-3’，nt 7728-7748)含有一个NF1结合位点。探针记采用末端标记法，500 ng Oligo与20μCiγ-32P-ATP混合，在T4DNA 多聚酶的作用下37℃反应1小时，酒精沉淀纯化。将20 000-40 000 Cerenkov cpm标记之Oligo与0.5μgHIS-YY1蛋白、5μg细胞核提取物在300μg/ml牛血清白蛋白、5μmol/L DTT、10 μmol/L亚精胺和0.5～1μg dIdC的条件下室温反应20分钟，行4%非变性PAGE电泳区分未结合之游离探针。PAGE胶经真空抽干后行放射自显影。竞争抑制试验中所用Oligo-AVV为腺样病毒DNA序列(5′-AGGGTCTCCATTTTGAAGCGGG-3′)。Oligo-T7为E.coliT7启动子序列(5′-TCGATAATACGACTCACTATAGGGAGAGATC-3′)。YY1特异性多克隆抗体为Dr.T.Shenk惠赠。与32P标记的Oligo反应之前，HIS-YY1蛋白及胞核蛋白先与50及400倍的未标记竞争Oligo以及0.5～3.0μl抗体反应20分钟。
1.6 荧光素酶(luciferase)检测 取10～20μl转染细胞提取物加至100μl测定液(0.1mmol/L K2PO4，15mmol/L MgSO3，50mg/ml ATP)在荧光素酶测定仪内与10ng D-luciferin(Boehringer公司产品)反应10秒钟，自动测定荧光素酶数值。取20-30μl细胞提取物与30μl 0.4μg/ml ONPG(Sigma公司产品)37℃作用1时，420nm测定的A值为β-gal表达数值。荧光素酶表达值为荧光素酶值/β-gal值之比。
2 结果
2.1 YY1蛋白广泛分布于人上皮细胞胞核内 YY1蛋白被认为是广泛存在于人和动物细胞核内的转录调节因子。为了进一步观测在HPV易感的角源细胞和宫颈癌细胞中YY1蛋白的存在情况，我们提取多种细胞核蛋白与经32P标记的、带有YY1结合位点的HPV 16 LCR双链DNA片段进行体外结合试验。以前实验已证实位于YY1位点内的A→G突变(nt 7843)可破坏该位点的YY1蛋白结合能力〔6〕。图1显示所有的被验细胞核提取物均可同Oligo-WT形成多个蛋白-DNA复合物，其中复合物D与HIS-YY1蛋白形成的复合物泳动速度相似。而这一复合物在与Oligo-PM的反应时消失。这提示复合物D的形成可能是由于内源性YY1蛋白所致。此外我们还发现在等量胞核提取物的条件下，各种细胞的内源性YY1蛋白在含量上无明显差异(图1)。与HIS-YY1蛋白形成的特异性复合物在泳动速度上的差别是由于HIS-YY1融合蛋白的分子量大于内源性YY1蛋白。为了进一步确定复合物D确系细胞内源性YY1蛋白所致，我们将HeLa细胞胞核提取物与带有YY1特异性结合位点的同源Oligo-AAV及非同源Oligo-T7行竞争性抑制试验。图2A显示，在400倍未标记的Oligo-AAV存在下复合物D条带消失。而在有等量未标记的Oligo-T7时所有复合物条带均未受明显影响。抗体抑制试验也显示，在YY1特异性抗体存在下复合物D条带消失(图2B)。这些结果证实复合物D确
图 1 细胞核提取物中内源性YY1蛋白的检测
1：HIS-YY1融合蛋白；2和5：C33a；3和6：HT3；4和 7：HeLa;8和10：SiHa;9和11:HKfF;12-17:HaCat
：细胞核提取物浓度递增；A-E：不同的DNA-蛋白复合物；F：未结合的Oligo
Fig．1 Identification of YY1 protein in the core-extracts from cell lines
Lane l: HIS-YY1 fusion protein expressed in E. Coli;lane 2 and 5:C33a;lane 3 and 6:HT3;lane 4 and 7:HeLa;lane 8 and 10:SiHa;lane 9 and lane 11:HKfF;lane 12-17:HaCat.:increasing concentration of the nuclear extracts,A to E:different DNA-protein complexes,F:unbound Oligos
图 2 Oligo WT竞争性抑制实验
A：AAV为腺样病毒双链序列，带有一个YY1结合位点；T7为T7启动子序列.：未标记竞争物浓度递增；-：未加未标记竞争物. B：YY1-Ab为YY1特异性多克隆抗体 ：YY1特异性抗体浓度递增；-：未加YY1特异性抗体
Fig.2 Competition assays for DNA-binding to Oligo WT
A: AAVis double-stranded sequences of adeno-associated virus containing a YY1 binding site. T7:T7 promoter sequence.:increasing concentration of unlabeled competitors.-:without any unlabeled competitor. B:YY1-Ab represents YY1 specific polyclonal antibody. :increasing concentration of YY1 specific antibody. -:without YY1 antibody
系由细胞内源性YY1蛋白所致。抗体抑制试验中的大分子量复合物是由于抗体的结合使复合物分子量加大。而其它复合物的出现可能是非特异性结合或是在所用的40bp长的Oligo上存在有其它活性蛋白结合位点所致。
2.2 HPV 16 LCR 序列上YY1结合位点的破坏可在多种细胞中诱导P97活性增强。我们曾经报道在YY1位点突变及缺失LCR序列控制下，P97活性在宫颈癌细胞系HT3中明显增强〔6，7〕。为了观测这一激活作用在其它HPV易感细胞中的存在情况，我们将插有HPV 16标准及突变LCR的荧光素酶质粒转染至子宫颈癌细胞系HeLa,C33a,SiHa,以及人角源细胞HaCat和HKfF.荧光素酶检测显示，启动子远端YY1位点突变(pT390-luc)在各种细胞内可诱导2.3-5.5倍的荧光素酶表达增强(图3)。LCR缺失突变(pT1326-luc)可在HeLa,SiHa,HaCat和HKfF细胞中引起3.4-11.3倍的荧光素酶表达增强，而在C33a细胞中却引起75%的P97活性抑制(图3)。这些结果与在HT3细胞中所获结果相似，提示HPV 16 LCR序列上YY1位点的破坏可在多种细胞中诱导P97活性增强。
2.3 C33a细胞中NFI蛋白含量高于HT3细胞 为了确定pT1326-luc在C33a细胞中引起P97活性抑制的原因，我们分析了这一115bp缺损DNA序列。除了两个启动子远端YY1结合位点外，这段序列还包括多个NF1结合位点。NF1蛋白是转录激活因子，可通过结合至相应的位点诱导P97活性增强〔9〕。我们将C33a和HT3胞核提取物与带有NF1结合位点、经32P标记的Oligo行体外EMSA试验。图4显示C33a胞核蛋白所形成的蛋白-DNA复合物明显强于HT3胞核提取物，这一结果表明C33a细胞核中含有较高含量的NF1蛋白。
3 讨论
对4种宫颈癌细胞系和2种人类角源细胞的检测证实胞核提取物中含有良好生物学活性的YY1蛋白，YY1位点破坏引起的HPV 16启动子P97活性增强效应广泛存在于所检细胞
图 3 不同细胞中荧光素酶检测
所有相对荧光素酶表达值均为三次不同转染平均值
Fig.3 Luciferase assays in different cell lines
All the relative luciferase expression values were averaged with three different transfections
内。广泛存在并具有良好体内、体外生物学功能的YY1调节系统构成了对HPV 16早期基因，特别是E6、E7基因表达的有力控制系统。对该系统的破坏似不是发生在YY1蛋白的表达水平，而可能是通过破坏其结合位点使YY1蛋白对P97的抑制作用丧失，从而使E6/E7癌基因能躲避这一监控系统而获高效表达。
被检测的宫颈癌细胞HT3和C33a为HPV阴性细胞，SiHa细胞带有整合状态的HPV 16 DNA，HeLa细胞带有整合状态的HPV 18 DNA。EMSA试验发现所形成的特异性YY1蛋白-DNA复合物在4种细胞之间无明差异，与正常人角源细胞也无明显差异。这说明细胞YY1蛋白的表达和含量不受病毒感染、病毒基因整合以及细胞癌变的影响。同时各细胞YY1蛋白生物学功能包括体外DNA结合和细胞内P97抑制作用也不受病毒DNA导入及细胞生长特性改变的影响。其它研究也提示宿主细胞YY1蛋白的功能不受包括EB病毒〔2〕、HIV〔3〕及HSV-1〔4〕短暂转染或长期感染的影响。
HKfF为正常人细胞，是HPV易感细胞。HaCat细胞是自然发生的人皮肤永生化细胞，具有许多正常细胞的生长特点。本试验结果证
图 4 C33a细胞中NF1蛋白含量高于HT3细胞
NF1：NF1-DNA特异性结合物；：细胞核提取物浓度递增
Fig.4 C33a cells contain more NF1 protein than HT3 cells
NF1 :The NF1-DNA specific complexes;:Increasing concentration of the nuclear extracts
实YY1位点破坏引起的P97激活效应存在于这两种细胞系内，这具有重要的生物学意义。过高的P97活性将诱导过量的E6/E7蛋白表达而使被感染细胞获得较高的癌变机率。可以推测带有类似YY1位点破坏的HPV16的感染可能会具有较HPV 16野毒株更高的致癌危险性。
对HT3和C33a细胞NF1蛋白的对比研究发现C33a细胞中NF1蛋白含量明显高于HT3细胞。这可能是造成缺损突变pT1326-luc在C33a细胞中引起P97活性抑制的原因。多个NF1点的缺失引起的P97抑制作用在C33a细胞中强于YY1位点缺失而致的增强效应。同时也提示不同的癌细胞其胞核蛋白的比例及含量不同。对宫颈上皮细胞中SP1蛋白研究发现这种转录激活因子在不同分化期，以及在永生化和转化细胞中的含量不同〔10〕。细胞核蛋白P21的表达在不同的细胞中也有明显差别〔11〕。这说明不同原因、时相发生癌变的同源细胞其胞核蛋白的表达状态可能不同。
参 考 文 献
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