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Preparation of hepatitis C virus nonstructural region antigens and detection of their relative antibodies
PENG Xiangxin
（Department of General Internal Medicine, China-Japan Friendship Hospital, Beijing, 100029, China）
WANG Qinhuan
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between HCV NS3 and the pathogenesis of HCV and research a method to assess the therapeutic effect of interferon (IEN) in clinicl.Methods In a retrospective research,we used HCV-NS3 antigens of different terminals expressed in E. coli. in which contained the recombinant plasmids involving amino terminal region (N′) or carboxyl terminal region(C′) of HCV-NS3, to detect the antibodies by Western blot in sera of 63 hepatitis C patients who were treated with IFN.Results It proved that antibodies against HCV-NS3 N′ and/or HCV NS3 C′ terminals in hepatitis C patients may predict the treatment result of IFN, especially in the patients with chronic hepatitis C.Conclusion The detection of antibodies against HCV-NS3 N′ and/or C′ terminals may be used for evaluation of IFN treatment, especially in chronic hepatitis C ones.
【Key words】 Hepatitis C; Hepatitis C virus (HCV); Gene, immunoglobulin; Genes, structural, viral; Sequence analysis
丙型病毒性肝炎(以下简称丙型肝炎)与乙型肝炎相比，由于在临床上常具有无明显症状和体征，易于形成慢性感染，肝硬化、肝癌发生率高等特点，而受到广泛重视。为了提供更好的指导诊断治疗和评价预后的方法，检测手段不断问世，如：测定抗-HCV的酶联免疫法(EILSA)，反映病毒复制状态的HCV-RNA多聚酶链反应(PCR)和基因分型、病理等各种方法，在临床早期诊断和献血员筛选方面有一定的应用价值。但在用于药物疗效和疾病预后判断方面仍不尽人意。
丙型肝炎病毒非结构区(HCV-NS3)是HCV基因组中较特殊的一个部分，它可编码不同功能的蛋白质，具有多种酶活性。在HCV复制中起重要作用。与丙型肝炎发病与复发密切相关。由于HCV-NS3不同末端的抗体，目前尚无检测的试剂盒，故应用分子生物学方法，分别将HCV-NS3氨基末端(N′)和羧基末端(C′)片段进行重组。利用在大肠埃希菌中所表达的相应蛋白作为抗原，检测血清中相应抗体，来探讨其与干扰素(Interferon,IFN)治疗疗效及预后关系。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料 限制性内切酶、pGEX(美国Promega公司)；pGEX Sepharose 4B试剂盒(瑞典Pharmacia公司)；大肠埃希菌JM109，BL21(日本TOYOSO公司)；牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、蛋白分析液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Bio-Rad公司)；丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒(日本HITACHI公司)；HCV-RNA PCR试剂盒(中国军事医学科学院)
1.2 HCV-NS3抗原制备
1.2.1 重组质粒DNA［1］ 采用pGEX-1λT表达载体，在多连接位点插入HCV-NS3片段。PCR扩增含有HCV-NS3 cDNA N′和HCV-NS3 cDNA C′的DNA片段，HCV-NS3 cDNA N′从3 354～4 210 bp，含pET 87 bp起始编码ATG和21 bp的终止编码TGA。HCV-NS3 cDNA C′从4 116～5 147 bp。引物序列如下：
NS3 cDNA N′：N1.5-CGGGCACGTTGTAGGCA-TC-3′
N2.5′-AACGGACGGCTTTAGGACGA-3′
NS3 cDNA C′
C1.5′-TGGGTACCTTATGGCAAGTTCCTCGCCGG-3′
C2.5′-TAGAATTCTACCAGTCCTACCTCGCCGCTG-3′
94℃1 min，55℃2 min，72℃3 min。40个循环。低融点琼脂糖电泳中回收HCV-NS3 cDNA N′和HCV-NS3 cDNA C′片段。限制性内切酶 XbaⅠ和EcoRⅠ处理DNA片段，插入pGEX-1λT载体。导入感受态大肠埃希菌JM109。转种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃温箱12～16 h。筛选阳性克隆。用碱裂解法提取重组质粒。用限制性内切酶酶切图谱确定插入方向。
1.2.2 HCV-NS3抗原制备 将含有正确表达方向的重组质粒，接种于含大肠埃希菌BL21 LB培养基，IPTG诱导重组质粒产生HCV-NS3 N′和C′蛋白。按pGEX Sepharose 4B蛋白纯化试剂盒说明书操作，纯化蛋白。10% SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，测定抗原性。电泳2～3 h。凝胶考马斯亮蓝染色，并转移至PVDF膜与标准的HCV-NS3抗体血清结合。
1.2.3 抗原性鉴定 用免疫印迹(Western blot)方法，检测含有蛋白抗原的PVDF膜，TENG-N液洗2次15 min/次［配方Tris (pH7.5) 50 mM,EDTA(pH 8.0) 5mM,NaCl 150 mM, 0.25%明胶，0.05% NP40］。加入已知抗HCV-NS3标准阳性血清。37℃1 h。TENG-N洗2次15 min/次。辣根过氧化酶标记羊抗人IgG抗体。37℃孵育，1 h。TENG-N洗2次，15 min/次。染色10 s［配方3，3-二氨基联苯胺20 mg,1M Tris (pH7.5) 4 ml, H2O2 28 μl,H2O 36 ml］。0.05 M HCl终止反应，10 s。
1.3 病例选择 根据1995年5月北京第五次全国传染病和寄生虫学术会议制定的《病毒性肝炎防治方案(试行)诊断标准》。选择丙型肝炎患者63例(男性54例，女性9例)。全部病例RT-PCR方法测定为HCV-RNA阳性。急性肝炎16例，慢性肝炎47例。63例患者中有输血制品史占87%，急性肝炎患者全部有输血制品史，慢性肝炎占60%。全部用IFN-α 2α治疗，300万单位肌注连续3天后，隔日一次，总疗程3个月。
1.4 丙型肝炎患者血清抗HCV-NS3 N′和C′检测 免疫印迹法。方法同前，仅将标准血清换成待测的患者血清。
1.5 抗HCV，HCV-RNA及ALT检测 方法略。
1.6 IFN治疗疗效判断标准 停药6个月后追踪观察结果进行判断。完全反应：HCV-RNA阴性，ALT正常；部分反应：除完全反应和无反应以外的病例，ALT明显下降，HCV-RNA阳性；无反应：ALT高于治疗前或与治疗前相同，HCV-RNA阳性；复发：治疗结束时，ALT正常，HCV-RNA阴性，在随访的6个月内又出现ALT升高，伴有或不伴有HCV-RNA阳性。
1.7 统计学方法 卡方检验。
2 结果
2.1 重组前后pGEX DNA限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切图谱，HCV-NS3见图1。HCV-NS3 N′为965 bp,HCV-NS3 C′为1 031 bp。
pGEX1=pGEX+HCV-NS3N′pGEX2=pGEX+HCV-NS3 C′
1 重组质粒pGEX BamHⅠ和EcoRⅠ内酶切签定
Fig.1 Restriction identification of the recombinant plasmids pGEX
(pGEX1/BamHⅠand EcoRⅠ,pGEX2/BamHⅠand EcoRⅠ)
图1显示：BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后在琼脂糖电泳上的DNA条带。图中标记Marker1和Marker2分别为标准核苷酸λ/Hind Ⅲ digest和φ174/X HincⅡ digest。
2.2 蛋白质表达和抗原性鉴定 重组质粒转入大肠埃希菌BL21后，异丙基硫代-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)诱导产生相对分子质量为49 000和32 000二条增宽蛋白带。用已知抗HCV-NS3阳性标准血清测定。Western blot测定后的HCV-NS3 N′和C′蛋白抗原性，见图2。经二氨基联苯胺(DAB)染色在相应相对分子质量32 000和49 000区出现的蛋白条带。证实为HCV--NS3 N′和C′蛋白。
图2 表达蛋白与HCV阳性血清的Western blot鉴定结果
Fig.2 Western blot analysis of the expressed proteins with hepatitis C positive serum
2.3 蛋白含量测定 蛋白显色液加入所需测定的蛋白液中，放置15 min，在595 nm处测定A值，通过标准曲线计算蛋白含量，为42～45 μg/μl。
2.4 血清中抗HCV-NS3 N′和C′检出情况分组及统计学处理
2.4.1 丙型肝炎患者血清抗HCV-NS3 N′和C′检出情况分组 患者按抗体检测情况分为4组：血清抗HCV-NS3 N′和C′检测及IFN疗效关系见表1。
表1 丙型肝炎患者抗NS3-N′和抗NS3-C′状态与IFN疗效关系
Tab.1 Relationship between status of HCV-NS3 N′, HCV-NS3 C′ of the patients and the therapeutic effect of IFN
| 对IFN反应
Response to IFN |
A组 例数(%)
A group Case(%) |
B组 例数(%)
B group Case(%) |
C组 例数(%)
C group Case(%) |
D组 例数(%)
D group Case(%) |
| 完全反应
Sustained response |
1(14.29) |
4(50.00) |
1(4.00) |
18(78.26) |
| 部分反应
Partial response |
2(28.57) | 2(25.00) | 5(20.00) | 3(13.04) |
| 无反应
Non response |
1(14.29) | 1(12.50) | 10(40.00) | 0(0.00) |
| 复发
Relapse |
3(42.86) | 1(12.50) | 9(36.00) | 2(8.70) |
| 合计
Total |
7 | 8 | 25 | 23 |
注：A组：抗NS3-N′(+)和抗HCV-NS3 C′(+).B组：抗NS3-N′(+)和抗HCV-NS3 C′(-).C组：抗NS3-N′(-)和抗HCV-NS3 C′(+).D组：抗NS3-N′(-)和抗HCV-NS3 C′(-)。
Note: A group: Anti-NS3 N′(+), anti-NS3 C′(+). B group: Anti-NS3 N′(+), anti-NS3 C′(-). C group: Anti-NS3 N′(-), anti-NS3 C′(+). D group: Anti-NS3 N′(-), anti-NS3 C′(-) 表1可见，统计学处理差异有显著性。组间两两比较，其中AB、AD、BC、CD组间P值分别为＜0.05或＜0.01。结果证实：在丙型肝炎患者中，抗HCV-NS3-N′和抗HCV-NS3-C′均阳性者，完全反应率低，而复发率高。
若患者按抗体检测情况分为抗NS3-C′阳性组：抗HCV-NS3 N′阳性、抗HCV-NS3 C′阳性和抗HCV-NS3 N′阴性、抗HCV-NS3 C′阳性的患者；抗NS3-C′阴性组：抗HCV-NS3 N′阳性、抗HCV-NS3 C′阴性和抗HCV-NS3 N′阴性、抗HCV-NS3 C′ 阴性的患者。Group 1：完全反应者；Group 2：部分反应，无反应和复发者。同时进行统计学检测，见表2。结果证明在丙型肝炎患者中，抗HCV-NS3 C′阳性者完全反应率低，复发率高。
表2 丙型肝炎患者完全反应和抗HCV-NS3 C′阳性、阴性组与IF疗效
Tab.2 Effect of IFN in relation with anti HCV-NS3 C′positive,negative and respond reaction of hepatitis C patients
| 组别
Group |
抗NS3-C′
Anti-NS3-C′ | |
| 阳性组 例数(%)
Group of positive case(%) |
阴性组 例数(%)
Group of negative case(%) | |
| 1a | 2(6.25) | 22(70.97) |
| 2b | 30(90.75) | 9(29.03) |
| 合计
Total |
32 | 31 |
注：P＜0.01 a：完全反应者；b：部分反应，无反应和复发者
Note: a: Sustained response. b: Partial response,nonresponse and the relapse
2.4.2 慢性丙型肝炎患者血清中抗HCV-NS3 N′和C′与IFN治疗疗效关系见表3。
表3 慢性丙型肝炎患者抗NS3-N′和C′状态与IFN治疗关系
Tab.3 Effect of IFN in relation with anti NS3-N′ or C′ status and respond reaction of chronic hepatitis C patients
| 对IFN反应
Response to IFN |
A组 例数(%)
A group Case(%) |
B组 例数(%)
B group Case(%) |
C组 例数(%)
C group Case(%) |
D组 例数(%)
D group Case(%) |
| 完全反应
Sustained response |
1(16.66) |
3(60.00) |
1(4.00) |
9(81.82) |
| 部分反应
Partial response |
1(16.66) | 1(20.00) | 5(20.00) | 1(9.09) |
| 无反应
Non response |
1(16.66) | 1(20.0) | 10(40.00) | 0(0.00) |
| 复发
Relapse |
3(50.00) | 0(0.00) | 9(36.00) | 1(9.09) |
| 合计
Total |
6 | 5 | 25 | 11 |
注：A组，B组，C组，D组抗HCV-NS3 N′,抗HCV-NS3 C′状态与表1同
Note:The status of anti HCV-NS3 N′ and anti HCV-NS3 C′ of group A,B,C,D is identieal with Tab.1. 从表3可见，统计学处理差异有显著性。组间两两比较，其中AB、AD、BC、CD组间P值分别＜0.05或＜0.01。结果证实：慢性丙型肝炎患者中，抗HCV-NS3-N′(+)、抗HCV-NS3-C′(+)者完全反应率低；而抗HCV-NS3-N′(+)和抗HCV-NS3-C′(-)、抗HCV-NS3-N′(-)和抗HCV-NS3-C′(-)者完全反应率高。
表4 慢性丙型肝炎患者完全反应和抗HCV-NS3 C′阳性、阴性组与IFN疗效
Tab.4 Effect of IFN in relation with anti HCV-NS3 C′ positive,
negative and respond reaction of chronic hepatitis C patients
| 组别
Group |
抗NS3-C′
Anti-NS3-C′ | |
| 阳性组 例数(%)
Group of positive case(%) |
阴性组 例数(%)
Group of negative case(%) | |
| 1a | 2(6.25) | 12(75.00) |
| 2b | 29(93.55) | 4(25.00) |
| 合计
Total |
31 | 16 |
a,b: Seen that in Tab.2 从表4可见，慢性丙型肝炎患者，亦是抗HCV-NS3 C′阳性者完全反应率低，而复发率高。统计学处理差异有显著性。因此HCV-NS3末端抗体的检测有可能作为IFN治疗丙型肝炎的疗效预测指标之一。
3 讨论
HCV-NS3按功能特点可分成N′和C′末端。HCV NS3 N端基因编码有丝氨酸蛋白酶活性的蛋白与非结构区蛋白翻译水平加工后的病毒蛋白生物活性有关，可用来推测HCV感染性的强弱［2，3］。C端编码的456个氨基酸，有RNA-刺激(RNA-stimulated)NTP酶和RNA解链酶活性［4］，这种RNA解链酶以与核苷三磷酸相结合的模式存在参与病毒的复制过程［5］，解链方向是从3′→5′端。由于与RNA复制中的解链有关，因此可用于判断复制活跃程度。
已证实HCV NS3在HCV株中具有保守性［6］。本实验应用HCV-NS3序列的N′和C′两段cDNA核苷酸序列，以pGEX为载体，重组cDNA转染大肠埃希菌，表达出有较高产量、良好抗原性和特异性的相应蛋白，已此作为抗原，用于检测丙型肝炎患者血中相关抗体。目前大部分HCV诊断试剂来源于合成肽或大肠埃希菌表达重组蛋白。合成肽抗原因缺乏蛋白天然构型而影响敏感性，大肠埃希菌表达重组蛋白可提高抗原纯度，这对保证特异性是十分重要的。从本研究结果看，应用HCV-NS3序列中两段cDNA核苷酸序列，以pGEX为载体，重组HCV-NS3 cDNA导入大肠埃希菌，可表达较高产量的相应蛋白(见图1)。纯化后的蛋白作为抗原，有良好抗原性，HCV-NS3抗体阳性血清与抗原具有较好的特异性反应(见图2)，证实它是一个良好的抗原来源。可用以检测丙型肝炎患者血清中的相关抗体。
研究应用HCV-NS3 N′和HCV-NS3 C′ cDNA表达相应蛋白作为抗原，检测丙型肝炎患者血中相关抗体，观察IFN治疗反应。追踪IFN治疗结束后6个月的ALT及HCV RNA结果与治疗前血清HCV-NS3 N′和HCV-NS3 C′抗体检测结果对照，观察其与IFN疗效关系。结果显示，丙肝型炎患者血清HCV-NS3不同末端抗体的阳性与IFN治疗疗效有一定关系(见表1.2)，统计学处理，P＜0.05或＜0.01有显著性差异，即抗NS3-C′阳性组完全反应率低于抗NS3-C′阴性组；而复发率高。特别是在慢性丙肝型炎患者(见表3.4)。
目前丙型肝炎抗病毒治疗仍认为IFN有确切疗效［7］。但有效率仅为20%～40%，且价格昂贵及有毒副作用。影响IFN治疗疗效有诸多因素，如患者年龄、病期、IFN剂量、疗程、HCV基因型和HCV-RNA含量等，但主要是与HCV-RNA含量有密切关系。HCV-RNA含量测定由于操作复杂、对血清标本保存要求高、成本高等不易在临床作为常规检查应用。因此HCV-NS3末端抗体检测方法似乎可反映HCV在体内的复制情况，有助于预测丙型肝炎患者的治疗反应，更好的选择丙型肝炎患者IFN治疗适应症，作为IFN治疗丙型肝炎疗效预测指标之一。且有检测方法简单及成本低的优点。由于病例数尚少，故此方法需进一步在临床验证。
参考文献
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4，Hong Z, Ferrari E, Wright-minogue J, et al. Enzymatic characterization of hepatitis C virus NS-3/4A complexes expressed in mammalian cells by using the herpes simplex virus amplification system. J Virol, 1996; 70: 4261-4268.
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