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【 摘要 】 目的 弄清只含白细胞介素6（IL-6）受体β亚基(gp130)胞外第二、三个FNⅢ区的可溶性突变体是否能拮抗IL-6的生物学效应。方法 首先用重叠延伸PCR方法扩增出gp130突变体cDNA；接着将其克隆到真核表达载体pSVL中；用脂质体转染法将此表达载体导入CHO细胞中，通过点杂交和反转录PCR证明其得到有效表达；用MTT法在杂交瘤细胞和白血病细胞中观察了此突变体对IL-6生物学效应的影响。结果 发现此突变体的表达上清具有拮抗IL-6所致的杂交瘤细胞7TD1增殖及白血病细胞R2生长抑制的作用。结论 gp130胞外第二、三个FNⅢ区中含有与IL-6/IL-6Rα形成复合物的部位。此结果为深入研究gp130胞外区的结构与功能以及针对gp130胞外区的小分子激动剂和拮抗剂的设计提供了一些依据。
Expression of soluble interleukin-6 receptor β subunit mutant and studies of its activity
YANG Zhihua, NI Changyuan, SHEN Beifen, et al.
(Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective To investigate whether the soluble IL-6 receptor β chain (gp130) containing the second and the third fibronectin type Ⅲ modules of the extracellular region can antagonize the biological effects of IL-6.Methods The sgp130 mutant cDNA was amplified by using overlaping extension PCR, cloned into a mammalian expression vector, pSVL, and expressed in CHO cells. The effect of the expressed protein on IL-6 biological effects were studied in a hybridoma cell line (7TD1) and leukemic cell line (R2) systems.Results The sgp130 mutant can counteract the effects of IL-6 on the proliferation of 7TD1 and the growth inhibition of R2 cells.Conclusion The second and the third fibronectin type Ⅲ modules of the extracellular region may contain the binding sites of gp130 to IL-6 and IL-6Rα.
【 Subject words 】 Interleukin-6; Glycoprotein 130; Mutant; CHO cell
白细胞介素6（IL-6）是一种多功能的细胞因子，参与免疫调控、造血、急性期反应等一系列生物学过程，并在神经、内分泌等系统中发挥重要作用〔1〕。IL-6的分泌异常也与多种疾病的发病机制相关，如自身免疫性疾病、多发性骨髓瘤及妇女绝经后的骨质疏松等〔2,3〕。IL-6受体（IL-6R）由两个亚基，即IL-6Rα和IL-6Rβ(gp130)组成。研究已证明，IL-6通过与其受体形成对称的六聚体复合物而发挥其生物学功能，该六聚体由2分子IL-6、2分子IL-6Rα和2分子gp130组成〔4,5〕。gp130是IL-6信号传入细胞内的唯一途径, 因此, 弄清gp130的结构与功能对于阐明IL-6的生理、病理作用机制以及对于IL-6相关疾病的治疗具有十分重要的意义。
gp130的胞外区含6个纤维粘连素Ⅲ（FNⅢ）型结构单元。其中第二、三个FNⅢ型结构单元(信号肽除外的第103～299位氨基酸)与IL-6Rα的两个FNⅢ型结构, 以及其他细胞因子受体的细胞因子结合区同源性很高, 含4个保守的半胱氨酸残基和一个WSχWS，很可能就是细胞因子结合区(CBD)。目前有关gp130胞外区结构与功能的研究很少。Horsten等〔6〕报道，由gp130远膜端308个氨基酸残基和IgG的Fc段形成的嵌合体分子能与IL-6、IL-6Rα形成复合体。倪长源等〔7〕进一步发现只含氨基端304个氨基酸的可溶性gp130片段具有拮抗IL-6效应的作用。本研究在以往工作的基础上，进一步了解只含胞外CBD区的可溶性gp130片段是否仍具有拮抗IL-6效应的作用。
材料与方法
材料及来源：质粒pBluescript-gp130由日本Hirano教授惠赠〔8〕。pUC18购于原平公司，pSVL购于Pharmacia公司。限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、EcoRⅠ及Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及质粒提取、纯化试剂盒均购自Promega公司。脂质体购自GIBCO公司。PCR引物为军事医学科学院基础所分子免疫室合成。
细胞培养：CHO细胞培养于DMEM培养基；大鼠白血病细胞系R2培养于RPMI 1640培养基；杂交瘤细胞7TD1培养于加IL-6和50μmol/L 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。除文中说明外，所有培养基均加10%小牛血清，青霉素和链霉素各100U/ml。细胞置37℃、5% CO2孵箱中培养。
可溶性gp130突变体的构建
引物设计与合成: 为了构建含信号肽和gp130 CBD区的可溶性gp130突变体，我们设计合成了4条引物，其中引物2和3分别含有与信号肽3′端及CBD区5′端互补的序列；引物2和3之间含有部分互补序列；在引物4中引入终止密码子。引物1: 5′-ACGGGATCCGCGCAAGATGTTGACG-3′, 引物2: 5′-GGTTTTTCTGGAGGACCTGTAGATTCAGTGG-3′, 引物3: 5′-GAATCTACAGGTCCTCCAGAAAAACCTAAA-3′, 引物4：5′-TTGGAGCTCAATAGGTGATCCCACTTGC-3′。
PCR和基因克隆: 以重叠延伸PCR扩增可溶性gp130突变体gpNA。具体步骤如下：第一轮PCR以质粒pBluescript-gp130为模板，引物1与引物2、引物3与引物4配对，分别扩增出信号肽及含CBD区的片段。PCR条件为：95℃变性10 min，加Taq酶，进入循环。循环参数为：94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min。30个循环后，72℃延伸8 min。取等量的第一轮PCR产物混合，作为第二轮PCR的模板。PCR条件为：95℃变性5 min，加Taq酶，进入循环1。循环1：94℃变性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸1 min，5个循环后，72℃延伸8 min，加入引物1、4各2μl，进入循环2。循环2：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，25个循环后，72℃延伸8 min。PCR产物经BamHⅠ和SacⅠ双酶切，克隆到pUC18质粒的相应位点，经测序验证后，克隆到表达载体pSVL。
细胞转染：转染前将5×105个CHO细胞接种入50ml培养瓶中，待细胞密度达到(60～70)%时进行转染。以5～10μg质粒DNA、10～20μl脂质体/瓶转染，具体步骤见说明书。
点杂交：参照文献〔9〕。
细胞增殖检测：细胞悬液调成(1～2)×105/ml, 加到96孔培养板内, 每孔100μl。IL-6及CHO表达上清按一定比例稀释后每孔加10μl, 以无血清RPMI 1640培养基作对照, 培养板置37℃, 5％ CO2孵箱内培养72 h。培养结束前4 h加浓度5mg/ml的MTT液10μl, 培养结束后加入100μl含0.1mol/L HCl的10% SDS溶液，过夜，充分振荡后在酶标仪上比色, 测量波长为570nm, 参考波长为630nm。取5次实验的平均结果。
结果
1.可溶性gp130突变体克隆和表达载体的构建及鉴定：经两轮PCR后，扩增出大约700bp的片段。将此片段插入pUC18中。序列测定结果与预定方案相吻合。将上述质粒用HindⅢ酶切，Klenow补平，再SacⅠ酶切，回收目的片段；pSVL以XhoⅠ酶切，Klenow补平，再SacⅠ酶切；然后用T4 DNA连接酶连接载体和片段。表达载体的构建见图1。正确插入片段两侧各有一个BamHⅠ位点，酶切鉴定结果见图2。
图1 可溶性gp130表达载体构建流程图
Fig 1. Construction of soluble gp130 genes
2.可溶性gp130突变体mRNA的表达检测：用脂质体转染方法将表达载体pSVLsgp130及空载体pSVL分别导入CHO细胞后60 h，收集细胞，提取总RNA，进行点杂交和反转录PCR。
图2 sgp130 gpNA的真核表达载体的酶切鉴定
Fig 2. Restriction maps of the expression vectors of sgp130 gpNA
1: pSVL-sgp/BamHⅠ; 2: pSVL-sgp1/SacⅠ; 3: pSVL/BamHⅠ； 4：pBR322/BstNⅠ
（1）sgp130 mRNA的点杂交检测；结果表明，转染pSVLsgp130的CHO细胞中有gp130突变体mRNA表达，而转染空载体及无DNA转染的对照细胞均没有杂交信号（图3）。
图3 点杂交检测转基因CHO细胞中sgp130 mRNA表达
Fig 3. Detection of sgp130 mRNA in transfected CHO cells
1: CHO cells; 2,3: cells transfected by pSVL, pSVL-sgp, respectively （2）sgp130 mRNA的RT-PCR检测结果：引物3和4配对(不含信号肽)，经反转录发现只有转染了可溶性gp130表达载体pSVL-sgpCHO细胞中能扩增出目的条带(图4)。
这一结果表明：CHO细胞中不表达gp130 mRNA; 转染空载体pSVL的CHO细胞中也不表达gp130 mRNA; 而在转染可溶性gp130表达载体pSVL-sgp的CHO细胞中, 由于导入了外源强启动子控制下的可溶性gp130基因, 这些基因在CHO细胞中得到有效表达。
图4 反转录PCR产物电泳图
Fig 4. Electrophoresis map of RT- PCR products
1：Marker ； 2,3：Cells transfected by pSVL-sgp, pSVL, respectively；4：CHO cells
3.sgp130生物活性检测 （1）sgp130突变体抑制IL-6诱导的7TD1细胞生长：7TD1是依赖于IL-6生长的杂交瘤细胞系,将不同浓度IL-6加入7TD1细胞培养物中, 观察细胞生长情况, 我们发现, 0.2ng/ml IL-6即明显促进其生长, 当IL-6浓度达1 ng/ml以上时饱和。将7TD1加入96孔培养板,培养基为含0.2ng/ml IL-6的RPMI 1640完全培养基, 每孔总体积为100μl (105细胞/μl)。加入1∶2倍比稀释的各种CHO上清浓缩液, 每种上清加入量分别为20、10、5、2.5μl (各实验组均设计3孔)。实验中还设有不加IL-6及只加IL-6的对照。结果显示，含sgp130的表达上清对7TD1生长有明显的抑制作用，并随上清体积加大而增强; 但转染pSVL的CHO上清对细胞生长并无显著影响（图5）。
图5 7TD1细胞中sgp130对IL-6效应的影响
Fig 5. Effects of sgp130 on the proliferation of 7TD1 cells stimulated by IL-6
Compared with control: *P＜0.05，**P＜0.01 (2) sgp130缓解IL-6对R2生长的抑制效应: 大鼠白血病细胞系LT12表面不表达人IL-6Rα分子, 而gp130含量丰富。实验结果表明, sgp130突变体上清能对抗IL-6对R2细胞生长的抑制作用，这种对抗作用随上清体积加大而增强，但转染pSVL的CHO上清对照组中，IL-6所抑制的细胞生长并无明显缓解(图6)。
图6 R2细胞中sgp130对IL-6效应的影响
Fig 6. Inhibitory effect of sgp130 on IL-6 in R2 cells
Compared with control: *P＜0.05，**P＜0.01 通过以上实验, 我们从对IL-6诱导的7TD1细胞生长和IL-6对R2细胞生长的抑制两方面均证实, sgp130突变体能拮抗IL-6的效应。也就是说, 含胞外区全长(597个氨基酸)和只含胞外CBD区的sgp130片段具有类似的生物学效应。
讨论
在IL-6诱导下，gp130形成以二硫键连接的同源二聚体，进而与IL-6/IL-6Rα形成三元复合物。该复合物为六聚体，即3种组分各2个分子。二聚体化的gp130通过其胞浆区相互作用并与胞内信号蛋白共同作用而激活胞内信号通路。人血清中存在相对分子质量（Mr）为90×103和110×103两种可溶性gp130分子, 它们均能与膜结合型gp130分子竞争性结合IL-6/IL-6Rα复合物，下调IL-6信号〔10〕; sgp130单抗则可完全阻断IL-6信号〔11〕。可见, gp130的胞外区参与IL-6受/配体复合物的形成。Horsten等〔6〕的研究发现，由gp130远膜端308个氨基酸残基和IgG的Fc段形成的嵌合体分子能与IL-6、IL-6Rα形成复合体。倪长源等〔7〕进一步发现，只含氨基端304个氨基酸的可溶性gp130片段具有拮抗IL-6效应的作用。我们知道，该片段内含有细胞因子受体超家族共同的细胞因子结合区（103～299位氨基酸）。上述研究结果表明，只含远膜端304个氨基酸的可溶性gp130可能通过与膜结合型gp130竞争结合IL-6/IL-6Rα复合物而拮抗IL-6的生物学效应。位于gp130远膜端的第二、三个FNⅢ单元内的细胞因子结合区很可能就是gp130参与IL-6受/配体复合物形成的部位。我们在上述研究的基础上，进一步构建并表达了只含gp130远膜端的第二、三个FNⅢ单元的gp130突变体，并发现此突变体仍能拮抗IL-6的生物学效应。这进一步证明了第二、三个FNⅢ单元是gp130参与IL-6受-配体复合物形成的部位。
gp130是IL-6、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、IL-11和心肌营养素-1(CT-1)共用的受体和信号传导子。这些细胞因子一方面因共用gp130而在功能上存在很多重叠，另一方面又有各自的特异性。研究表明，以上细胞因子与gp130的结合位点可能是各不相同的，不同的gp130抗体可以中和不同细胞因子的效应〔12〕。若能进一步找出gp130上与不同细胞因子特异作用的位点，不仅有助于阐明不同因子特异作用的原因，而且有助于针对某一因子的特异小分子激动剂、拮抗剂的研究，以促进相关疾病的治疗。
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