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鼠抗rhGM-CSF单克隆抗体的研制
中国免疫学杂志 1999年第3期第15卷 免疫学技术与方法
作者：谢 虹 熊 伟 宋新荣 任启生
单位：北京江中药物研究所，北京 100050
中国图书分类号 R392.12
人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是人体免疫系统产生白细胞过程中的重要蛋白质，能刺激多种造血细胞的增殖、分化及活化作用［1］。临床上用rhGM-CSF治疗放疗、化疗引起的粒细胞减少症，已取得了一定的疗效［2］。本文运用杂交瘤技术成功地建立了4株能稳定分泌抗rhGM-CSF单克隆抗体的细胞株，对各株单抗的免疫化学特性进行了研究，同时对融合方法进行了一定的探讨。这些研究为单抗的进一步应用提供了依据。
1 材料与方法
取本所自制的rhGM-CSF对Balb/c小鼠进行3次常规免疫。融合前3 d，取50 μg的rhGM-CSF对小鼠脾内和腹腔同时加强免疫，融合方法用常规PEG1000法和电融合法。用间接ELISA进行抗体筛选，并连续进行3次克隆化，所得的阳性杂交瘤细胞经扩大培养后接种小鼠腹腔制备腹水；腹水的纯化采用辛酸-硫酸铵两步沉淀法［3］；对单抗进行多种测定。
2 结果
制备出的4株杂交瘤细胞IF7、JE3、LB10、LD12均为PEG融合所得，经连续传代培养3个月以上或液氮冷冻保存6个月后复苏，细胞分泌抗体的能力均不改变。特异性鉴定表明，4株单抗均与不同来源的rhGM-CSF有强阳性反应，而与rhG-CSF、rhIL-3、HSA等无反应。进一步测定表明，4株单抗对相应抗原的亲和力分别为6.05×106、2.31×107、6.98×106、2.33×107 mol-1，类型均为IgG1亚类。4株单抗的相加指数(A.I.)均小于50%，表明它们识别同一组抗原决定簇。单抗IF7、JE3、LD12的最适包被浓度分别为36.9、56.8、19.3 μg/ml，而LB10有11.45和2.86 μg/ml两个最适包被浓度。
3 讨论
研究表明GM-CSF分子的第88～121残基间二硫键相关的氨基酸是抗原决定簇所在部位，其中88～96位间的脯氨酸富集区(-88C-P-P-T-P-E-T-S-96C-)是最保守的；抗原决定簇不仅与抗原分子的氨基酸序列有关，还与其空间构象有关。4株单抗虽然识别同一组抗原决定簇，但有不同的最适包被浓度，可能与抗体识别的抗原决定簇的具体氨基酸有关。
在相加实验中出现了A.I.小于零的现象，其原因可能是：抗体亲和力对实验结果的影响；抗原决定簇与单抗分子的大小不相称；抗原与抗体结合后诱导抗原构象发生改变，使抗体的结合力下降，这也从侧面说明了出现A.I.小于零的情况是可能的。
进行电融合时给细胞外加电压时，膜电压的改变与细胞的半径成正比。根据稳态条件下膜电势Vm0=1.5aE0cosθ，在θ为0°和180°时将出现膜击穿。事实上，免疫小鼠脾细胞小于瘤细胞，当脾细胞刚刚达到击穿电压时，瘤细胞却早已被击穿，二者难以成功地融合。后将瘤细胞用一定浓度的链霉蛋白酶处理，提高其对电场作用的稳定性，则使融合率大大提高。在PEG融合中，只要控制好反应温度和PEG与细胞接触的反应时间，也能取得较好的结果。另外在融合前将骨髓瘤细胞SP2/0接种于Balb/c小鼠背部皮下，为其生长代谢提供了良好的微环境，有利于细胞迅速进行有丝分裂，且生长状态优于体外培养。取这种体内生长的SP2/0实体瘤细胞与免疫脾细胞融合，获得了较为满意的结果；经统计，PEG的融合率为3%，最后的阳性率为33%。
单抗亲和力的测定为它的进一步应用提供了依据；高亲和力的抗体可以用于定量检测及导向治疗，低亲和力的抗体可制备亲和层析柱，进行相应抗原的纯化；实际工作中可以根据具体情况来选择相应的抗体。我们成功地制备出GM-CSF特异的单克隆抗体，为进一步建立免疫学的检测方法打下了基础。
作者简介：谢 虹，女，26岁，助理工程师，主要研究细胞免疫学；
任启生，男，40岁，教授，博士生导师，主要研究分子生物学
4 参考文献
1 Dipersio J F,Billing P,Kaufman S et al. Characterization of the human GM-CSF receptor.J Biol Chem,1988;263:1834
2 Vadham-Raj S,Keating M,LeMaistre A et al. Effects of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in patients with myelody-splastic syndromes. N Engl J Med,1987;317:1547
3 叶群瑞，陈伯权，吴美英.一种简单、快速、量大的辛酸纯化单克隆抗体法.生物化学与生物物理进展，1991；18(1)：60
〔收稿1998-04-03 修回1998-06-01〕