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甲状腺素体外对Graves病T、B细胞功能异常影响的研究
中国免疫学杂志 1999年第7期第15卷 临床免疫学
作者：刘 铭 潘菊芬 白 虹 冯 凭 尹 潍
单位：天津医科大学总医院内分泌科，天津300052
关键词：Graves病；甲状腺素；T淋巴细胞；B淋巴细胞
中国图书分类号 R392.6
摘 要 目的：探讨Graves病(GD)患者异常升高的甲状腺激素与免疫异常之间的因果关系，和抗甲抗腺药治疗GD期间加用甲状腺素(T4)的作用。方法：将GD患者外周血单个核细胞(PBMC)在不同浓度的T4条件下体外培养6 d后，检测T细胞亚群和培养上清中可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)及IgG的含量。结果：与正常对照组相比培养后的GD患者PBMC中CD8+T细胞亚群百分率明显减少(P＜0.01)；培养上清中sIL-2R及IgG水平显著升高(P＜0.01)；T4体外对上述指标无明显影响。结论：GD患者同时具有T、B细胞异常；T4体外对GD患者的T、B细胞功能异常无影响，异常升高的甲状腺激素可能为GD患者免疫异常的结果而不是导致免疫异常的原因。
The study of the effect of thyroxine on T，B cells abnormalities in graves' disease patients
LIU Ming, PAN Ju-Fen, BAI Hong et al.
Department of Endocrinology, Tianjin Medical University Hospital, Tianjin 300052
Abstract Objective: To clarify whether there are T,B cells abnormalities in Graves' disease(GD) patients and the relationship between those abnormalities and thyroxine(T4), further investigate the effect of T4 administration on the risk of relapse of hyperthyroidism during antithyroid drug therapy.Methods: Peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of GD patients and nomal individuals' were incubated at absent or present of different concentration of T4. The supernatant of cell cultured were used for detecting IgG and sIL-2R and cell pellet were asayed for detecting PBMC surface CD molecules.Results: In GD patients, the percentage of CD8+ T subset was decreased and CD4+/CD8+ cell ratio and the level of sIL-2R and IgG were increased (P＜0.01). T4 had no effect on above parameters(P＜0.05).Conclusion： There are not only B cell but also T cell function abnormalities in GD patients. The fact that T4 had no effect on T,B function in vitro infer that the excessive thyroxine is outcome but not the reason of T,B abnormal in GD patients.
Key words Graves' disease Thyroxine T lymphocyte B lymphocyte
Graves病(GD)是一种器官特异性自身免疫性疾病，其免疫学发病机理尚示完全被揭示。有研究发现，GD患者在应用抗甲状腺药物(ATD)治疗期间，随着甲状腺功能的恢复，其异常免疫功能也转向恢复，它们之间的因果关系至今尚无定论［1］；同时，近些年来有研究显示，在ATD治疗期间，加用甲状腺素(T4)可显著降低GD病人自身抗体滴度，减低停药后的复发率［2］。因此探讨甲状腺激素对机体免疫细胞的影响就成为一个非常有意义的研究课题，目前国内外关于这方面的研究很少。本研究应用T淋巴细胞亚群、免疫球蛋白G(IgG)及sIL-2R三项指标同步检测了GD病人T、B细胞功能状态，以探讨GD病人体内是否存在这两种细胞的异常，同时观察了甲状腺素(T4)体外对GD患者免疫异常的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 未治疗GD患者25例，其中男5例，女20例，平均年龄41.4±10.8岁，确诊根据临床症状、体征、游离甲状腺激素水平升高，自身抗体(TRAb，TSI)阳性。对照组为健康正常人25名，无肝肾功能改变，近期无感染性疾病，其中男5名，女20名，平均年龄40.5±9.2岁。
1.2 实验方法
1.2.1 PBMC分离和培养 用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)将抗凝外周血经梯度离心获得PBMC，用RPMI 1640培养液洗2次后，以含20%小牛血清RPMI 1640培养液调细胞终浓度为1×106个/ml，然后分为3组，A组PBMC+PWM(10 μg/ml)+T4(1 ng/ml)，B组PBMC+PWM(10 μg/ml)+T4(5 ng/ml)，C组PBMC+PWM(10 μg/ml)，然后置于5%CO2、恒温37℃的培养箱中培养6 d。美洲商陆(PWM)、T4均为美国Sigma公司产品。将培养后的PBMC离心1 000 r/min，5 min，取培养上清-20℃保存待检测IgG和sIL-2R时用，其中15例沉淀细胞供检测T细胞亚群用。
1.2.2 T细胞亚群的检测 按许屏等免疫荧光法检测人外周血淋巴细胞亚群的方法，检测培养后PBMC表达CD3、CD4、CD8的细胞数，每份标本计数200个细胞，计算花环阳性百分率［3］。所用试剂为CD3、CD4、CD8单抗致敏的红细胞花环试剂(卫生部武汉生物制品研究所)。
1.2.3 sIL-2R和IgG的检测 取培养上清为待测样品，采用ELISA双抗体夹心法检测sIL-2R和IgG的含量。试剂盒分别由白求恩医科大学免疫室和协和医科大学基础医学研究所提供，按盒中说明操作。所有标本均一次检测。
1.3 统计学方法 数据均以x±s表示，组间比较采用两样本均数的t检验。
2 结果
2.1 GD病人PBMC培养后T淋巴细胞亚群的检测结果 由表1可见，GD病人CD8+T细胞百分率明显降低，CD4+／CD8+比值显著升高。不同浓度的T4对T淋巴细胞亚群百分率无明显影响(表2)。
表1 Graves病患者和正常对照PBMC培养后T淋巴细胞亚群的比较(x±s，%，n=15)
Tab.1 Comparison of T lymphocyte subsets of GD patients and control after culture(x±s，%，n=15)
| CD3 | CD4 | CD8 | CD4／CD8 | |
| GD patients | 60.5±11.1 | 33.6±5.8 | 22.4±5.41) | 1.52±0.241) |
| Controls | 65.8±11.3 | 34.1±7.5 | 32.2±6.5 | 1.08±0.28 |
Note:1)significantly different (P＜0.01) between GD patients and controls
表2 甲状腺素体外对GD患者PBMC培养后T细胞亚群的影响(x±s，%，n=15)
Tab.2 Effect of thyroxine on T lymphocytes subsets of GD patients' PBMC in vitro(x±s，%，n=15)
| Groups | CD3 | CD4 | CD8 |
| PBMC+PWM+T4(1 ng/ml) | 58.3±10.2 | 29.2±8.4 | 24.3±8.5 |
| PBMC+PWM+T4(5 ng/ml) | 57.6±10.7 | 28.6±7.8 | 23.8±7.9 |
| PBMC+PWM | 60.5±11.1 | 33.6±5.8 | 22.4±5.4 |
Note:no significantly different(P＞0.05) among groups
2.2 培养上清中sIL-2R和IgG含量 如表3所示，GD病人PBMC培养上清中IgG和sIL-2R的含量较正常对照组明显升高，不同浓度的甲状腺素体外对于IgG和sIL-2R的量无明显影响(表4)。
表3 GD患者PBMC培养上清中的IgG和sIL-2R的变化(x±s，n=25)
Tab.3 Change of sIL-2R and IgG in PBMC culture supernatant of GD patients(x±s，n=25)
| IgG(ng/ml) | sIL-2R(U/ml) | |
| GD patients | 780.4±151.81) | 735.4±333.91) |
| Controls | 306.7±60.9 | 401.0±57.0 |
Note:1)significantly different(P＜0.01) between GD patients and controls
表4 甲状腺素体外对GD患者PBMC培养上清sIL-2R和IgG的影响(x±s，n=25)
Tab.4 Effect of thyroxine on level of sIL-2R and IgG of GD patients' PBMC in vitro(x±s，n=25)
| Groups | sIL-2R(U/ml) | IgG(ng/ml) |
| PBMC+PWM+T4(1 ng/ml) | 92.9±242.9 | 710.8±147.6 |
| PBMC+PWM+T4(5 ng/ml) | 711.8±330.6 | 705.2±166.8 |
| PBMC+PWM | 735.4±333.9 | 780.4±151.8 |
Note:no significantly different(P＞0.05) among groups
3 讨论
T、B细胞功能异常存在于多种自身免疫性疾病中。本研究结果发现，GD病人PBMC不仅具有B细胞分泌免疫球蛋白的异常亢进，而且存在有对B细胞产生抗体过程中有重要调节作用的T细胞功能的异常，表现为CD8+T细胞百分率下降，CD4+／CD8+比例失衡，T细胞的免疫抑制功能下降，机体对自身组织的免疫耐受性下降而导致异常免疫应答的产生。
白细胞介素是在白细胞间发挥重要作用的一类细胞因子。其中白细胞介素-2(IL-2)是体内最主要最强有力的T细胞生长因子，是保障机体正常免疫反应的关键环节。sIL-2R是由被激活的T细胞释放出来的，它可作为T细胞被抗原激活的一种标志，其对IL-2依赖的免疫反应具有双向调节作用［4］。本研究结果发现GD病人PBMC培养上清中sIL-2R的含量较正常对照明显升高，说明病人体内存在着免疫系统的激活，由于sIL-2R的升高，使其与IL-2的结合增多，致使IL-2与淋巴细胞膜上的IL-2R(mIL-2R)结合减少；同时sIL-2R的升高也可能为mIL-2R代偿性脱落增多所致。这两方面作用的结果使得淋巴细胞膜上的mIL-2R接受刺激减少，进而使活化状态的免疫细胞恢复至静止状态，过度的免疫反应得到一定的调控。因此，上清中sIL-2R的升高可能为机体对于免疫过度兴奋的一种自我抑制机制，sIL-2R在GD患者的免疫反应中起着重要的负向调节作用。
异常升高的甲状腺激素是GD病人最重要的临床特征，该激素水平的变化在GD的发生和发展中起着重要的作用。由于ATD治疗期间免疫系统的变化是在甲状腺激素水平恢复至正常后发生的，而且有研究发现，ATD治疗甲状腺功能恢复正常以后加用T4可以降低自身抗体滴度，减少停药后复发率［2］，但近来研究显示出相反的结论［5］，因此，明确甲状腺激素对免疫系统变化所起的作用是目前临床急待解决的一项课题。虽然有研究显示，甲状腺功能状态与机体某些免疫指标有一定的关联［6，7］，但是，由于体内影响免疫系统的因素很多，而且甲状腺激素的作用范围非常广泛，它对某一系统的作用既可能是直接作用，也可能是通过影响其它组织器官而间接达到的。所以，不能仅从临床上发现某些免疫指标与甲状腺素存在某些联系而推断甲状腺激素一定对免疫系统有直接影响。
本研究发现，甲状腺素体外对于GD病人PBMC分泌抗体、sIL-2R的量和淋巴细胞亚群均无明显影响，说明甲状腺素体外对淋巴细胞功能无直接影响。造成体内外结果差异的原因可能有以下几点：①甲状腺素在体内对于免疫系统的作用可能是通过它对其它组织器官的影响而间接达到的，如它可以通过影响甲状腺细胞免疫学信号的表达或胸腺素的分泌而间接影响免疫系统的功能状态，本实验由于未将这些环节包括进去而产生体内和体外研究结论的差异。②在体内产生生物学效应的甲状腺激素主要是T3，而本实验所应用的为T4，这方面也可产生结论的不同。③甲状腺激素对于机体免疫系统确实无明显影响，而通过体内研究所得出的结论可能是由于其它因素干扰所造成的。
本研究结果提示：GD患者体内有T、B细胞活化状态存在，说明GD病人同时具有T、B细胞异常，并可能为该病发生的始动因素；甲状腺素体外对GD病人T、B细胞异常无直接影响，似可说明过量的甲状腺激素可能是GD免疫系统异常的结果而不是促使免疫异常的原因，临床上在ATD治疗GD期间加用T4对该病免疫异常的恢复似无直接的作用。
作者简介：刘 铭，男，33岁，内分泌专业博士研究生；
尹 潍，女，68岁，教授，博士生导师，主要从事内分泌代谢病的研究
4 参考文献
1 Weetman A P, Mcgregor A M. Autoimmune thyroid disease: Futher developments in our understanding. Endocrine reviews，1994;15(6):788
2 Hashizum K, Ichikawa K, Sakurai A et al. Administration of thyroxine in treated Graves' disease. N Engi J Med, 1991;324:947
3 许 屏，任怡敏，梁 玉 et al. 淋巴细胞单抗致敏的红细胞花环试剂和荧光法检测人外周血液的淋巴细胞.中国组织化学与细胞化学杂志，1993；2(2)：19
4 Chow C C, Lai K N, Leung J C K et al. Serum soluble interleukin 2 receptor in hyperthyroid Graves' disease and effect of carbimazoletherapy. Clin Endocrinol， 1990;30:3171
5 Max R, Alain R, Myriam R et al. Effect of thyroid status on thyroid autoimmunitity expression in euthyroid and hypothyroid patient with Hashimotos thyroiditis. Clin Endocrinol, 1994;40:529
6 Roger S R, Abbot E C, Douglas R et al. Effect of methimazole, with or without L-thyroxine, on remission rates in Graves' disease. J Clin endocirnol Metab, 1998;83:814
7 Fabris N, Mocchegiani E, Marriotti S et al. Thyroid-thymas interactions during predevelopment and aging. Horm Res, 1989;13:85
收稿1998-05-27 修回1998-08-28