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淫羊藿甙逆转转化生长因子β2对LAK、CD3AK细 胞的免疫抑制作用
中国免疫学杂志 2000年第5期第16卷 中医中药与免疫
作者：李晓燕 张玲 王芸 毛海婷 刘炬 温培娥
单位：李晓燕（山东省医学 科学院基础医学研究所,济南250062）；张玲（山东省医学 科学院基础医学研究所,济南250062）；王芸（山东省医学 科学院基础医学研究所,济南250062）；毛海婷（山东省医学 科学院基础医学研究所,济南250062）；温培娥（山东省医学 科学院基础医学研究所,济南250062）
关键词：淫羊藿甙；转化生长因子β；LAK细胞；CD3AK细胞；穿孔素
摘 要 目的：探讨淫羊藿甙逆转转化生长因子β2(Transform ing Growth Factor β2，TGFβ2)对LAK、CD3AK细胞的免疫抑制作用及其机制。方法：采用 MTT法,RT-PCR和流式细胞术。结果：淫羊藿甙能逆转受TGFβ2抑制 的LAK和CD3AK细 胞的杀伤活性，并能部分恢复受TGFβ2抑制的LAK细胞表面IL-2Rα表达和CD3AK细胞 内穿孔素mRNA水平,以及CD3AK细胞的增殖活性。结论：淫羊藿甙通 过恢复LAK细胞IL-2Rα 表达，提高CD3AK细胞内穿孔素mRNA水平及促进CD3AK增殖，逆转TGFβ2对LAK 、CD3AK的免疫抑制作用。
中国图书分类号 R730.5
Reversal of transforming growth factor β2 mediated immunosuppression of LAK and CD3AK by Icarrin
LI Xiao-Yan ZHANG Ling WANG Yun
（Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062）
Abstract Objective:To study the reversal of trans f orming growth factor β2(TGFβ2) mediated immunosuppression of LAK and CD3 AK cells by Icarrin and its mechanisms.Methods:MTT assay, RT-PCR , Flow Cytometry.Results:ICA can reverse TGFβ2 mediated suppression of the cytotoxic activity of LAK and CD3AK cells.It can also reve rse TGFβ2 mediated downregulation of IL-2Rα expression on LAK cells and pe rforin mRNA level in C D 3AK cells.Conclusion:The mechanisms of ICA function is pro bably due to its capability of reversal TGFβ2- mediated suppression of IL-2 Rα expression on LAK cells and perforin mRNA level in CD3AK cells.
Key words ICA Transforming growth factor β LAK CD3 AK Perforin
TGFβ是一类非常强的免疫抑制因子，由多种肿瘤细胞产生，可强烈地抑制T 细胞的增殖及CT L细胞、NK细胞、Mφ细胞，LAK、CD3AK、TIL细胞的杀伤活性〔1〕，并与过继 免疫治疗疗效不佳有直接关系，如果能够阻断其免疫抑制作用，将有利于控制肿瘤的发展， 提高肿瘤的治疗效果。淫羊藿甙(Icarrin,ICA)是一种免疫增强剂和抗肿瘤制剂,具有调节免 疫功能,诱导白血病细胞分化、凋亡,逆转实体瘤细胞恶性表型等作用〔2-4〕 。本文对ICA逆转TGFβ2的免疫抑制作用及其机制进行研究,以阐明ICA抗癌作用的新机制 。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、细胞株 淫羊藿甙(ICA)从朝鲜淫
羊藿中提取,纯度96%以上,性质稳定。rh TGFβ2购自Sigma公司;rhIL-2购自北京瑞得合通有限公司;CD3单克隆抗体为本所田志 刚研究员惠赠。FITC-CD25单抗,FITC-CD16单抗,CD4-FITC,CD8-PE,C D3PE -Cy5单抗均为Immunotech公司产品。 TRIzol Reagent购自GIBCO-BRL公司；DEP C,dATP,dTT P,dGTP,dCTP,M-MLV Reverse Transcriptase,Taq DNA Polymerase均购自华美公司。人肺 巨细胞腺癌PG，人髓样白血病K562细胞为本室保存。
1.2 PCR扩增引物 β-actin正引物序列为5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3 ，负引物 序列为5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3，购自北京医科大学病理系，扩增片段为326 bp；穿孔素 正引物序列为5’TGTATGATGGCTGGGG3，负引物序列为5’CCTGTGGTAAGCATGCT3’,片段大小 为523 bp,由赛百盛公司合成。
1.3 LAK和CD3AK细胞的诱导培养及ICA、rhTGFβ2的处理 健康人外 周抗凝血经淋巴 细胞分离液分离PBMC ,调整细胞浓度至1×106ml-1,加入IL-2 1 000 U/ml诱导LA K细胞;加IL -2 100 U/ml,CD3单抗0.1 μg/ml诱导CD3AK细胞。两诱导系均设①常规诱导对照组； ②25、 50 μg/ml ICA处理组；③rhTGFβ2 5、10 ng/ml处理组；④逆转组rhTGFβ2 5、10 ng /ml+ICA 50 μg/ml。各诱导处理组细胞置37℃,5%CO2饱和湿度培养,其中rhTGFβ2组和 逆转组 均在第3天补加相同浓度的rhTGFβ2。
1.4 MTT法检测ICA逆转TGFβ2对LAK和CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用 参照文献［5］略加改进。
1.5 MTT法检测ICA和TGFβ2对CD3AK增殖的影响 将各处理组CD3AK 细 胞1×106ml-1接种于96孔板中,每孔200 μl,培养至3、4、6 d,MTT法检测增殖活性 。
1.6 流式细胞术检测ICA逆转TGFβ2对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用 收集培养至3 d 的LAK各处理组细胞,分别加100 μl 1∶10稀释的FITC-CD25单抗，避光作用0.5 h ，PBS洗1次，上机检测。
1.7 RT-PCR法检测ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞穿孔素mRNA水平的抑 制作用 收集培养 至第4天的各处理组CD3AK细胞,RNA提取按TRIzol Reagent说明书操作，逆转录和PCR扩增 参照文献〔6〕。
1.8 RT-PCR产物定量 Gel Dos1000凝胶图像分析仪扫描底片各带,以β- actin为内参照,测定穿孔素基因mRNA相对表达量。
1.9 统计处理 t检验、χ2检验。
2 结果
2.1 ICA逆转TGFβ2对LAK细胞杀伤活性的抑制作用 如图1、2所示，IC A 50 μg/ml不仅提高不同效靶比的LAK杀伤和NK样杀伤活性，并且阻断rh TGFβ2的抑制作用,将受抑的LAK杀伤活性和NK样杀伤活性恢复至正常水平。
2.2 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用
2.2.1 CD3AK细胞表型分析结果 诱导至第4天的CD3AK细胞表型为CD ＋ 362.19%,CD＋425.77%,CD+836.94%,CD+1632.25%,CD+2517.51% ,表明 CD3AK细胞是以T细胞为主的异质性细胞群，CD8+细胞所占比例较高。
2.2.2 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用 如图3所示，ICA不仅可在一定程度上提高CD3AK的杀伤活性，并逆转rhTGFβ2对CD 3AK杀伤活性的抑制作用。
图1 培养至第3天的各处理组LAK细胞对PG细胞的杀伤活性
Fig.1 The killing activity of control and treated LAK by rhTGFβ2，
I CA against PG cells
Note:Compared with control，P＜0.05，P＜0.01；compared with rhTGFβ2 treatment，▲P＜0.05，▲▲P＜0 .01
图2 培养至第3天的各处理组LAK细胞对K562 细胞的NK样杀伤活性
Fig.2 The killing activity of control and treated LAK cells by ICA,
rhTGF β2 against K562 cells
Note:Compared with control，P＜0.05，P＜0.01；compared with rhTGFβ2 treatment，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01[ ZK)
图3 培养至第4天的各处理组CD3AK 细胞对PG细胞的杀伤活性
Fig.3 The killing activity of control and treated CD3AK cells
by ICA、TGFβ2 against PG cells
Note:Compared with control，P＜0.05，P＜0.01；compared with rhTGFβ2 treatment，▲P＜0.05
表1 ICA、rhTGFβ2处理3 d的IL-2Rα阳性LAK 细胞数的变化
Tab.1 Changes of IL-2Rα expression on LAK cells treated by ICA、
rhTGF β2 for 3 days
| Dose(μg/ml) | Number of CD25
posi tive cells (/10 000) |
Expression rate of CD25
(%) |
| Control | 1 904 | 19.01 |
| ICA 25 | 2 6171) | 26.17 |
| ICA 50 | 3 8701) | 38.70 |
| rhTGFβ25 ng/ml | 8951) | 8.95 |
| ICA 50+TGFβ25 ng/ml | 1 6502) | 16.50 |
note:compared with control,1)P＜0.01；compared with rhTGFβ 2 treatment，2) P＜0.01
图4 穿孔素基因RT-PCR扩增片段的电泳分析结果
Fig.4 DNA electrophoresis analysis of perforin gene mRNA
expression of CD3AK treated by ICA, rhTGFβ2
Note:Lane A.PCR marker 1 543,994,695,515,377,237 bp;Lane B.Contr ol；Lane C.rhTGFβ 2 10 ng/ml treatment;Lane D.ICA 50 μg/ml treatment;Lane E.ICA 50 μg/ml and rhTGFβ2 10 ng/ml treatment
2.3 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞的增殖抑制作用 ICA协同诱导CD3 AK比常规CD 3AK在第4、6天增殖率明显提高,诱导起始加入rhTGFβ210 ng/ml,可显著抑制CD3AK增 殖 ;ICA在作用的第3、6天可逆转TGFβ2对CD3AK的增殖抑制作用。
2.4 ICA逆转TGFβ2对LAK细胞表面IL-2R表达的抑制作用 诱导系中 加入ICA可显著 提高LAK细胞表面IL-2Rα的表达水平，呈剂量依赖效应；诱导初加入rhTGFβ25 ng/ml 即可显 著抑制IL-2Rα表达；ICA可逆转rhTGFβ2对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用，但尚未 完全恢复至正常水平(表1)。
2.5 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞穿孔素mRNA水平的抑制作用 诱导至 第4天的CD3AK 细胞,以β-actin为内参照，穿孔素基因mRNA相对表达量为0.751 3, rhTGFβ2 10 ng/ ml处理后,穿孔素基因扩增条带较对照变浅,半定量值降低为0.005, ICA 50 μg/ml 处理组条带 明显加深,半定量值由0.751 3增高至4.429 9,逆转组穿孔素mRNA水 平在一定程度上得以恢复，半定量值由0.005提高至0.300(图4)。
3 讨论
研究表明，在肿瘤局部微环境中,由于免疫抑制因子积累聚集,可使肿瘤局部成为深度免 疫抑 制的“黑洞”,干扰了进入肿瘤组织中正常免疫细胞的功能,使之成为“沉默”细胞〔7 〕,其中TGFβ是肿瘤微环境中常见的抑制功能最强的一类免疫抑制因子。本研究发现,TGF β2能够显著抑制LAK,CD3AK细胞对PG和K562细胞的杀伤活性,而ICA可将受抑制 的LAK和CD3AK杀伤活性恢复至正常水平。ICA作为LAK和CD3AK细胞的活性增强剂,既可直 接提高其杀伤活性,又可防止其回输体内后,受免疫抑制因子影响而成为没有功能的“沉默 ”细胞,因而联合使用ICA有助于提高肿瘤过继免疫治疗效果。
IL-2是T细胞,LAK细胞等增殖活化所必需的,当IL-2与IL-2Rα链以低亲和力结合后, 诱导受体 α、β、γ链形成高亲和力受体,然后通过结合于β亚基的Lck激酶,将信号传递至核内,引起 与淋巴细胞增殖活化有关的基因表达［8］。我们研究发现5 ng/ml rhTGFβ2可明 显抑制IL-2活化的LAK细胞表面IL-2Rα表达,而ICA能够在一定程度上恢复LAK细胞受TGFβ 2抑制的IL-2Rα水平,这可能是ICA逆转TGFβ2抑制LAK细胞杀伤活性的机制。
Michael等曾观察到rhTGFβ2可诱导IL-2依赖T细胞系CTLL2凋亡［9］。我们 实验观察到rhTGFβ2能够抑制CD3AK细胞增殖,但未发现TGFβ2诱导
CD3AK细胞凋亡 现象。ICA 促进CD3AK细胞增殖的同时,还可逆转TGFβ2对CD3AK的增殖抑制作用,这 可能是ICA恢复受TGFβ2抑制的CD3AK杀伤活性的机制之一。
研究表明，IL-2及CD3单抗可迅速诱导T细胞、NK细胞中穿孔素mRNA水平增加,增强其mRNA 稳定性,从而提高杀伤细胞内穿孔素表达,增强细胞 毒活性［10］。由于穿孔素基因转录是杀伤性T细胞活化早期事件，因此Smyth等 证明，TGFβ对IL-2、CD3单抗诱导T细胞中穿孔素mRNA水平的抑制作用， 发生在诱导的 初始阶段［11］。我们的研究结果与Smyth等报道一致,rhTGFβ2 10 ng/ml可明 显 抑制CD3AK穿孔素mRNA水平,其相对表达量较正常对照降低100倍;ICA能够提高其穿孔素mRN A水平，并在一定程度上恢复受TGFβ2抑制的穿孔素mRNA表达,这可能是ICA逆转TGFβ 2抑制CD3AK杀伤活性的又一重要机制。
本文阐明了ICA抗肿瘤作用的新机制,为ICA临床应用提供了新的理论和实验依据,但ICA影响T GFβ表达及阻断TGFβ作用的分子机制仍需进一步探讨。
作者简介：李晓燕，女，26岁，免疫学专业硕士生；
张玲，女，49岁，研究员，硕士生导师，主要从事免疫调节及肿瘤免疫方面研究
4 参考文献
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9，Michael W，Daniel B C, Ursula M et al. Transforming growth factor β2i nduce s apoptosis of murine T cell clones without downregulating bcl-2 mRNA expressio n. Eur J Immunol,1994;24:1293
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［收稿1999-07-10 修回1999-11-12］