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肿瘤患者自体CD3AK与LAK细胞生物学特性研究
中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 肿瘤免疫学
作者：徐琪 安秀梅 邵莹 和世彦 郝希山
单位：徐琪（天津医科大学附属肿瘤医院天津市肿瘤研究所免疫室，天津300060）；安秀梅（天津医科大学附属肿瘤医院天津市肿瘤研究所免疫室，天津300060）；邵莹（天津医科大学附属肿瘤医院天津市肿瘤研究所免疫室，天津300060）；和世彦（天津医科大学附属肿瘤医院天津市肿瘤研究所免疫室，天津300060）
关键词: CD3AK；LAK；生物学特性
摘 要 目的：CD3AK细胞是由抗CD3单克隆抗体和IL-2共同激活诱导的肿瘤杀伤细胞。对30例肿瘤患者自体CD3AK细胞及LAK细胞进行了比较性研究。方法：采用MTT法检测CD3AK细胞及LAK细胞的杀瘤活性，应用流式细胞术进行免疫标志物分析。结果与结论：肿瘤患者PBMNC诱导后产生的CD3AK细胞较LAK细胞有更强的增殖能力，但对Raji、K562细胞的生长抑制作用无明显区别；40%～60% CD3AK细胞表达CTL样表型（CD3+CD8+），约40%CD3AK细胞表达NK表型（CD56+）。同时亦观察到不同患者的免疫功能存在明显的个体差异。
中国图书分类号 R392.12
Biological features of auto CD3AK and LAK induced from tumor patients
XU Qi，AN Xiu-Mei，SHAO Ying
（Tianjin Cancer Hospital, Cancer Institute, Dept. of Immunology, Tianjin, 300060）
Abstract Objective: CD3AK cells were tumor-killing cells induced by costimulation of anti-CD3McAb and IL-2. We studied the difference between the auto CD3AK and LAK cells from 30 tumor patients.Methods:MTT colorimetric assay was used to show the cytotoxicity of CD3AK and LAK cells. The cell immunological characters were checked up by FCM.Results and Conclusions:CD3AK cells induced from tumor patients' PBMNC were more proliferous than LAK cells, and had no difference in cytotoxicity against Raji or K562. 40%～60% of CD3AK cells were phenotypes of CTL cells（CD3+CD8+）,about 40% expressed phenotypes of NK cells（CD56+）. We also reported that there was some difference among tumor patients in immunological function.
Key words CD3Ak LAK Biological features
CD3AK（Anti-CD3 Antibody induced activated killer cells）是抗CD3单克隆抗体和IL-2共同激活的杀伤细胞，具有强体外增殖能力、高效细胞毒活性。是继LAK、TIL细胞后又一具有杀伤肿瘤作用的免疫活性细胞，近年来受到有关研究人员的重视。本文对30例肿瘤患者PBMNC用不同方式进行诱导，观察了CD3AK及LAK细胞在增殖能力、细胞毒活性及细胞免疫表型方面的差异。为进一步研究CD3AK细胞的杀伤肿瘤作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 重组人IL-2（北京四环）；CD3 McAb及荧光抗体抗CD3，抗CD4，抗CD8，抗CD25，抗CD56，抗CD45RO / CD8抗体（DAKO公司）； Cell proliferation kit I（MTT）（Boehringer mannheim公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 血标本的来源 30例经病理证实的恶性肿瘤患者，男18例，女12例，年龄35～65岁，平均年龄52岁，同一份血标本分别进行CD3AK及LAK细胞研究。
1.2.2 杀瘤细胞的培养 肿瘤患者外周血经CS-3000 plus血细胞分离机（Baxter）采集，淋巴细胞分层液密度梯度离心分离单个核细胞(PBMNC)。将分离后的PBMNC在15%胎牛血清RPMI 1640中，分别用：① IL-2 1 000 U/ml； ② CD3McAb 300 U/ml +IL-21 000 U/ml调整细胞浓度为2×105ml-1诱导培养14 d，于倒置显微镜下观察。
1.2.3 杀瘤细胞免疫表型分析 收集CD3AK及LAK细胞，用抗CD3，抗CD4，抗CD8，抗CD25，抗CD56，抗CD45RO / CD8荧光抗体进行直接免疫荧光方法标记，流式细胞仪测定。
1.2.4 细胞增殖抑制实验（MTT法） 肿瘤细胞系Raji、K562（本室保存）为靶细胞，维持培养于含15%胎牛血清的RPMI 1640中，实验前24 h换液，使细胞处于增殖期。CD3AK细胞、LAK 细胞为效应细胞，效靶比例为5：1，混合孵育，用MTT显色法检测杀伤活性［1］。用多功能酶标仪（Labsystems Multiskan）于570nm测定细胞活性。
结果判定公式：
2 结果
2.1 肿瘤患者CD3AK及LAK细胞的增殖情况 PBMNC细胞经不同诱导方式培养2 w后计数，可见CD3AK较LAK细胞显著增殖，见表1。30例中有5例患者CD3AK及LAK细胞均无明显扩增。另有3例患者两种诱导方式均出现少量贴壁细胞。
2.2 CD3AK及LAK效应细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用 将培养2 w的CD3AK及LAK细胞按5：1的效靶比例分别与Raji、K562共同孵育24 h后，镜下均可观察到效应细胞向肿瘤细胞的趋化与包围现象。CD3AK细胞、LAK细胞对靶细胞的抑制率无差异(P＞0.05)，见表2。30例中有21例CD3AK及LAK细胞对靶细胞的抑制率分别大于均值，9例的抑制率小于均值。
2.3 肿瘤患者CD3AK细胞、LAK细胞免疫表型 CD3AK细胞中40%～60%表达CTL样表型(CD3+，CD8+），约40%表达NK表型（CD56+）。CD3AK细胞中CD25+细胞较LAK细胞明显增多。14例患者效应细胞经IL-2或CD3McAb+IL-2诱导2 w后，CD25+、CD56+细胞呈平行上升；9例患者仅CD25+细胞升高；7例患者CD25+、CD56+细胞均未见升高。 CD8+亚群中CD45RO+ 在CD3AK细胞、LAK细胞均占20%以上(见表3)。
表1 效应细胞增殖情况（
Tab.1 Proliferation of the tumor-killing cells （
| Cells | Cell number(×105/ml) |
| LAK | 12.04±2.65 |
| CD3AK | 21.98±3.97 |
note：P＜0.05
表2 效应细胞对肿瘤细胞生长抑制作用（5:1）（
Tab.2 Cytotoxicity of tumor-killing cells （
| LAK(%) | CD3AK(%) | P | |
| Raji | 37.62±2.49 | 35.33±2.88 | ＞0.05 |
| K562 | 45.15±2.90 | 41.91±3.27 | ＞0.05 |
表3 效应细胞免疫表型（
Tab.3 Phenotypes of tumor-killing cells（
| LAK(%) | CD3AK(%) | P | |
| CD3 | 62.78±4.73 | 67.43±4.85 | ＞0.05 |
| CD4 | 20.40±1.55 | 21.50±1.84 | ＞0.05 |
| CD8 | 46.16±3.55 | 49.85±3.18 | ＞0.05 |
| CD25 | 32.57±4.57 | 47.97±5.64 | ＜0.05 |
| CD56 | 38.77±2.45 | 44.15±3.44 | ＞0.05 |
| CD45RO/CD8 | 27.63±4.28 | 23.37±3.36 | ＞0.05 |
3 讨论
CD3AK细胞是一种新型的抗肿瘤免疫活性细胞，是具有高效激活与扩增能力的异质性细胞群［2，3］。我们观察并分析研究了30例肿瘤患者自体CD3AK及LAK细胞，结果表明：CD3AK较LAK细胞有更强的增殖能力（P＜0.05）,其细胞免疫表型以CTL样细胞（CD3+CD8+）和NK细胞（CD56+）为主，与文献报道一致［2，3］。在体外抗肿瘤作用方面，未观察到CD3AK细胞具有优于LAK细胞的杀瘤活性（P＞0.05）。
CD3单克隆抗体具有丝裂原作用，可激活淋巴细胞，将此激活的淋巴细胞加入低剂量IL-2，即可维持长期活性增殖［3-5］。本研究中发现CD3AK细胞中IL-2R（CD25+细胞）较LAK细胞明显增多（P＜0.05），合理地解释了应用CD3单克隆及低剂量IL-2即可诱生CD3AK细胞的现象。我们还观察到扩增的CD3AK和LAK细胞中CD8+细胞20%以上来自于静止的CD8+细胞。
我们的研究提示了CD3AK细胞作为生物治疗手段之一，具有良好的前景。研究中还发现肿瘤患者的免疫功能存在明显差异，少数患者PBMNC对诱导几无反应。观察到3例患者PBMNC经诱导有少量贴壁细胞，有待于进一步研究。
作者简介：徐琪，女，27岁，实习研究员，从事肿瘤免疫与生物治疗的研究工作
作者单位：郝希山（天津医科大学附属肿瘤医院天津市肿瘤研究所免疫室，天津300060）
参考文献
1，Mario Ferrari, Maria chiara Fornasiero,Anna Maria Isetta. MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity. J Immunol Methods, 1990;131:165
2，Augusto C Ochoa, Diane E Hasz, Rebecca Rezonzew et al. Lymphokine-activated killer activity in long-term cultures with anti-CD3 plus interleukin 2: indentification and isolation of effector subsets. Cancer Res, 1989;49:963
3，Cynthia M Loeffler, Jeffrey L Platt, Peter M Anderson et al. Antitumor effects of interleukin 2 liposomes and anti-CD3-stimulated T-cells against murine MCA-38 hepatic metastasis. Cancer Res, 1991;51:2127
4，Yeon-Sook Yun, Myrthel E Hargrove, Chou-Chik Ting. In vivo antitumor activity of anti-CD3-induced activated killer cells. Cancer Res, 1989;49:4770
5，Shu-Mei Liang, Chi-Ming Liang, Myrthel E Hargrove et al. Regulation by glutathione of the effect of lymphokines on differentiation of primary activated lymphocytes. J Immunol, 1991;146:1909
［收稿1999-11-07，收回2000-03-28］