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人气管粘膜上皮细胞抗菌多肽探讨
中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 临床免疫学
作者：黄宁 程德云 潘小玲 吴琦 唐彬 王伯瑶
单位：黄宁（华西医科大学感染免疫研究室，成都610041）；程德云（华西医科大学感染免疫研究室，成都610041）；潘小玲（华西医科大学感染免疫研究室，成都610041）；吴琦（华西医科大学感染免疫研究室，成都610041）
关键词：支气管肺泡灌洗液；气管上皮细胞；抗菌多肽
摘 要 目的：探讨人支气管肺泡灌洗液和体外气液界面无血清培养的人气管上皮细胞分泌液对绿脓杆菌的抗菌作用。方法：采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（AU-PAGE）分析人支气管肺泡灌洗液阳离子蛋白成分；气液界面无血清培养人气管上皮细胞；电泳凝胶琼脂糖弥散法和琼脂糖弥散法检测支气管肺泡灌洗液及培养细胞分泌液的抗菌活性。 结果：人支气管肺泡灌洗液和培养气管上皮细胞分泌液对绿脓杆菌有很强的抗菌作用；随着盐浓度增加，抗菌作用减弱。AU-PAGE发现一电泳迁徙率明显高于α-防御素和溶菌酶的阳离子抗菌多肽。结论：提示人气管粘膜上皮细胞能合成和分泌与α-防御素或溶菌酶不同的抗菌多肽，可能是呼吸道抗感染的重要分子。
中国图书分类号 R392.1
Antimicrobial peptides of human tracheal epithelial cells
HUANG Ning，CHENG De-Yun，PAN Xiao-Ling
（West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041）
Abstract Objective:To study antibacterial effect of bronchoalveolar lavage fluid and of secretions from human tracheal epithelial cells cultured with serum-free hormone-supplemented medium at air-liquid interface. Methods: AU-PAGE was applied to analyze the peptide composition of bronchoalveolar lavage fluid. Human tracheal epithelial cells were cultured in serum-free hormone- supplemented medium with a biphasic chamber system, which provided an air-liquid interface, an environment more closely resembling to the in vivo situation. Agarose radial diffusion assay and gel overlay technique were applied to detect the antibacterial activity of human bronchoalveolar lavage fluid and the secretions of cultured human tracheal epithelial cells. Results: Bronchoalveolar lavage fluid and the secretions of cultured human tracheal epithelial cells showed potently antibacterial activity against P.aeruginoa and the antibacterial activity was diminished at high concentration of NaCl. One protein band with potent antibacterial activity, which differed from α-defensins and lysozyme, was found by gel overlay technique. Conclusion: The result provided evidence that human tracheal epithelial cells can synthesize and secret antimicorbial polypeptide(s) which differ from α-defensins and lysozyme.
Key words Bronchoalveolar lavage fluid Tracheal epithelial cells Antimicorbial polypeptide
最新研究表明，内源性抗生素肽（endogenous antibiotic peptides）是哺乳动物（包括人类）粘膜屏障抵御致病性微生物侵袭的关键介质［1］。1997年Godman等［2］采用原位杂交发现全程呼吸道粘膜上皮有β-防御素mRNA表达，认为绿脓杆菌等病原微生物能定植、集落于囊性纤维化患者的呼吸道粘膜，主要是由于囊性纤维化患者呼吸道粘膜β-防御素功能失活。但1998年Schnapp等对此提出了疑问，认为溶菌酶、α-防御素才是呼吸道粘膜上皮主要的抗菌分子［3］。确定呼吸道粘膜的主要抗菌分子对呼吸道感染及抗感染防御机制的认识有重要意义。 鉴于此，本文对人支气管肺泡灌洗液和气液界面培养的人气管上皮细胞抗菌多肽进行了分析，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂为Merck产品，溶菌酶、琼脂糖、胎盘胶原、各种生长因子为Sigma产品，DMEM/F12培养基为Gibco产品，套皿(1.2 cm)为Millipore产品，角蛋白抗体、免疫组化试剂盒为Dako产品。α-防御素从人中性粒细胞溶酶体颗粒分离纯化，参见文献［4］。
1.2 人气管上皮细胞培养 健康成人新鲜气管由我校移植免疫中心提供。参照文献［5］方法， 用低温酶消化法获取人气管粘膜上皮细胞，采用气液界面无血清培养方式培养，1 w后用PBS反复冲洗套皿及底层24孔板，撤去培养基抗生素继续培养，并每隔48 h收集套皿内上清及底层培养基备用。
1.3 人支气管肺泡灌洗液处理 正常成人支气管肺泡灌洗液由我校附一院呼吸内科采集。灌洗液经离心去除沉淀，以分子截流量3 500的透析袋于4℃透析48 h，冷冻干燥。溶于0.01%乙酸备用。
1.4 人支气管肺泡灌洗液AU-PAGE分析 按文献［6］的方法作酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（AU-PAGE），凝胶浓度12.5%，胶厚0.75 mm，凝胶于150 V预电泳150 min，加样后电泳90 min，电泳后凝胶用考马斯亮蓝染色，设溶菌酶及人α-防御素为对照。
1.5 抗菌活性检测 采用Lehrer等介绍的方法行人支气管肺泡灌洗液和培养细胞分泌液抗菌实验，抗菌者呈现溶菌条带［7］。所用菌株为绿脓杆菌ATCC27853株（P.aeruginosa ATCC27853）。
1.5.1 电泳凝胶琼脂糖弥散法 人支气管灌洗液经AU-PAGE电泳后，用10 mmol/L PBS（pH7.4）振荡洗涤3次，每次10 min，将电泳凝胶置于含菌底层琼脂上（含1%琼脂糖，0.03%营养肉汤粉，10 mmol/L pH5.5柠檬酸-磷酸氢二钠，对数生长期细菌105个/ml），37℃孵育3 h，移除电泳凝胶后，在底层含菌琼脂上覆盖一层2×营养琼脂（含1%琼脂糖，6%营养肉汤粉），继续孵育24 h。
1.5.2 琼脂糖弥散法 在直径9 mm的塑料培养皿内，倒一层含菌的底层培养基（同上），在底层培养基上打直径3 mm的圆孔，每孔加5 μl细胞培养上清，37℃孵育3 h后，在底层上覆盖一层2×营养琼脂，孵育24 h。
2 结果
2.1 人气管上皮细胞的气液界面无血清培养 用酶低温消化获得的人气管上皮细胞，气液界面无血清培养，细胞呈现复层生长，免疫组化检查，细胞角蛋白染色呈阳性反应， 可确认为气管上皮细胞（见图1a、b、c）。
2.2 人支气管肺泡灌洗液AU-PAGE电泳分析 人支气管肺泡灌洗液、溶菌酶、α-防御素的AU-PAGE电泳结果见图2a。由图箭头所示，支气管肺泡灌洗液中有一阳离子多肽，其迁徙率明显高于溶菌酶和α-防御素。
2.3 抗菌活性检测
2.3.1 人支气管肺泡灌洗液抗菌活性 电泳凝胶琼脂糖弥散法显示人支气管肺泡灌洗液中新发现的阳离子多肽对绿脓杆菌呈现很强的抗菌活性（见图2b箭头所示），此外在相当于溶菌酶和α-防御素的迁徙处，也出现相应的抗菌条带。当抗菌实验底层培养基中含145 mmol/L NaCl（即生理盐水）时，溶菌酶和α-防御素的抗菌活性消失，而人支气管肺泡灌洗液阳离子多肽仍有一定抗菌活性（见图2c箭头所示）。当底层培养基中NaCl浓度增加至3×生理盐水时，人支气管肺泡灌洗液阳离子多肽抗菌活性消失。
2.3.2 人气管上皮细胞培养上清抗菌活性 琼脂糖弥散法显示培养细胞上清对绿脓杆菌有明显的抗菌活性。随着底层培养基中NaCl浓度的增高，杀菌环直径逐渐减小，当NaCl浓度分别为0、 20 、40 、80、160 、320 mmol/L时，杀菌环直径分别为12.0、11.5、10.0、9.0、4.5、3.0 mm。无血清细胞培养基对绿脓杆菌无抗菌活性（见图3）。
3 讨论
3.1 呼吸道粘膜存在盐敏感的抗菌多肽 呼吸道与外环境相通，易受到外源性病原微生物感染，但在生理状况下，下呼吸道维持无菌状态。最新的研究成果显示，呼吸道上皮细胞合成和分泌抗菌多肽，是维持呼吸道无菌状态的重要机制之一。Diamond等［8］ 九十年代初最先发现牛气管上皮细胞抗菌多肽，且炎症介质能明显增强抗菌多肽的表达。人呼吸道上皮细胞是否同样合成抗菌多肽，直到最近两年的研究才有所突破。Goldman［2］在探讨肺囊性纤维化病人反复罹患呼吸道绿脓杆菌感染的机制中，将人支气管上皮细胞种植于经冻融剥脱粘膜层的大鼠气管，然后异种移植于nu/nu BALB/C小鼠，收集移植的气管灌洗液与细菌共培养，经菌落计数法检测发现其有杀菌活性，而肺囊性纤维化患者气管上皮细胞异种移植的气管灌洗液，因其盐浓度过高，其杀菌作用减弱，由此提出人支气管粘膜存在盐浓度敏感的抗菌多肽。本实验直接收集人支气管灌洗液，采用电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌实验，显示其中确有对绿脓杆菌有很强抗菌作用的多肽分子，且随盐浓度增高，其抗菌活性明显减弱直至消失。
图1 气液界面无血清培养的人气管上皮细胞(×400)
Fig.1 Human tracheal epithelial cells cultured with serum-free hormone-supplement medium at air-liquid interface(×400)
Note:a.HE Staining;b.Keratin immunostaining;c.Negative control
2 人支气管肺泡灌洗液AU-PAGE及抗菌活性检测
Fig.2 Antibacterial activity assay by gel overlay technique of bronchoalveolar lavage fluid
Note:a.AU-PAGE；b.antibacterial activity;c.antibacterial activity wih 1×normal saline
图3 气液界面无血清培养气管上皮细胞分泌液琼脂糖弥散法抗菌活性检测
Fig.3 Detection of the antibacterial activity of secretions from cultured human tracheal epithelial cells by agarose radial diffusion assay
3．2 呼吸道粘膜抗菌多肽的细胞来源及分子类型 呼吸道粘膜抗菌分子可来源于粘膜上皮细胞或吞噬细胞。采用体外培养的人气管上皮细胞检测其分泌液的抗菌活性，可避开免疫和炎症细胞的干扰，以确定抗菌多肽的细胞来源。90年代以来，培养人气管上皮细胞的主要进展是利用无血清气液界面培养方式，更好地模拟气管上皮细胞在体内的天然生长环境，促进细胞的生长增殖、分化成熟和功能表达［5］。因此本实验用该方法培养了健康成人气管上皮细胞，采用敏感的琼脂糖弥散法检测了培养细胞分泌液对绿脓杆菌的抗菌作用，结果证实气管粘膜上皮细胞能合成和分泌抗菌分子。
防御素是一类分子量为3～4 kD的抗菌多肽，根据其二硫键的不同分为α-防御素和β-防御素。人α-防御素现已发现6个分子，即HNP1-4和HD5-6，HNP1-4存在于中性粒细胞溶酶体颗粒内，HD5-6在小肠Paneth细胞合成［9］。人β-防御素已发现2个分子，即hBD-1和hBD-2。HBD-1最初从血液透析液分离获得，并证明主要在肾小管上皮细胞合成和分泌［10］，后经深入研究表明它亦广泛表达于粘膜及腺体上皮细胞［11］。hBD-2新近从人皮肤上皮细胞分离获得［12］。Goldman等［2］在核酸水平用原位杂交的方法证实，从气管到终末细支气管呼吸道全程上皮细胞有hBD-1基因表达，认为hBD-1是呼吸道粘膜的主要抗菌分子。但在蛋白质水平的研究有人却得出不同结果。1998年Schnapp等用高效液相色谱法，从人支气管肺泡灌洗液只分离纯化出α-防御素及溶菌酶，而未获得β-防御素，提出呼吸道粘膜起主要抗菌作用的是α-防御素、溶菌酶，而不是β-防御素［3］。本实验利用正常成人支气管肺泡灌洗液进行了酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，发现除有与溶菌酶和α-防御素相似的电泳条带外，还可见在其前方有一阳离子多肽，电泳凝胶琼脂糖弥散法显示其抗菌活性明显高于溶菌酶和α-防御素。由于α-防御素和溶菌酶主要来自炎症细胞，因此正常呼吸道粘膜的主要抗菌分子可能并非α-防御素和溶菌酶，而是气管粘膜上皮细胞自身分泌的抗菌多肽。或许呼吸道感染发生炎症时α-防御素和溶菌酶才成为主要的抗菌分子参与抗感染防御［13］。本实验在正常成人支气管肺泡灌洗液中发现的阳离子多肽是否为β-防御素，抑或是新的抗菌分子，与培养上皮细胞分泌的抗菌物质是否属于同一分子还有待于对其进行进一步的分离纯化及一级结构分析。
课题受国家自然科学基金(No.39670305)、纽约中华医学基金会(No.98-681)资助
作者简介：黄 宁，男，36岁，副教授，主要从事天然免疫研究
唐彬（华西医科大学感染免疫研究室，成都610041）
王伯瑶（华西医科大学感染免疫研究室，成都610041）
参考文献
1，Hancock R E W. Peptide antibiotic. Lancet，1997； 349:412
2，Goldman M J, Anderson G M, Stolzenberg E D et al. Human α-defnsin-1 is a salt-sensitive antibiotic in lung that is inactived in cystic fibrosis.Cell, 1997；88: 553
3，Schnapp D,Harnis A.Antibacterial peptides in bronchoalveolar lavage fluid.Am J Respir Cell Mol Biol,1998;19(3):352
4，吴 琦，徐罗玲，王伯瑶. 人中性粒细胞防御素的分离纯化. 中国免疫学杂志，1993；9（2）：106
5，Yamaya M, Finkbeiner W E, Chun S Y et al. Differentiated structure and function of cultures from human tracheal epithelium.Am J Physiol,1992；262(6):L713
6，Panyim S, Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histon. Arch Biochem Biophs, 1969; 130:337
7，Lehrer R I, Rosenman M, Harwig S S l et al. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial peptides. J Immunol Meth, 1991；137:167
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10，Bensch K W, Raida M, Magert J et al. hBD-1: a novel α- defensin from human plasma. FEBS Lett， 1995；368:331
11，Zhao C, Wang I, Lehrer R I et al. Widespread expression of beta-defensin hBD-1 in human secretory glands and epithelial cells. FEBS Lett, 1996； 396:312
12，Harder J, Bartels J, Christophers E et al. A peptide antibiotic from human skin. Nature, 1997; 387 : 861
13，Ashiani J, Mukae H, Nakazato M et al. Elevated concentrations of defensins in bronchoalveolar lavage fluid in diffuse panbronchiolitis.Eur Respir J，1998；11(1):104
［收稿1999-04-28，二次修回1999-09-10］