点击显示 收起
表面表位包埋法制备肿瘤表面抗原P185neu/c-erbB-2单克隆抗体及其性质研究
中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 免疫学技术与方法
作者：王琛 李昀 李平 刘兢 杨正洪 吕源冈 朱德厚 张荣兴 姚阳 吴强 管伟宁 杨枫
单位：王琛（中国科学技术大学生命科学学院，合肥230027）；李昀（中国科学技术大学生命科学学院，合肥230027）；李平（中国科学技术大学生命科学学院，合肥230027）；刘兢（中国科学技术大学生命科学学院，合肥230027）
关键词：neu/c-erbB-2癌基因；P185；单克隆抗体McAb；细胞表面表位包埋法
摘 要 目的：细胞表面表位包埋法(SEM)是一种选择细胞表面特定的表达分子制备单克隆抗体的新途径。由于P185neu/c-erbB-2是乳腺癌及其他肿瘤的一个重要表面标志，这个研究旨在应用SEM法制备特异性好，灵敏度高的P185单克隆抗体并分析其特性以便于临床。方法：采用细胞表面表位包埋法免疫BALB/C小鼠，常规杂交瘤技术进行细胞融合，ELISA法测定，有限稀释法克隆化。结果：筛选得到3株能稳定分泌抗人癌基因erbB-2产物P185蛋白的McAb杂交瘤细胞。经间接免疫过氧化物酶染色和流式细胞术分析证明该McAb特异性与P185阳性细胞膜结合，而不与结构类似的EGFR膜阳性细胞结合。免疫印迹实验证明这些McAb特异地与P185蛋白结合，病理切片免疫组化结果证明该单抗对乳腺癌组织呈特异膜阳性反应。结论：SEM法制备的肿瘤表面抗原P185的McAb杂交瘤具有很好的用于临床诊断肿瘤抗原P185的价值及工程化改造的前景。
中国图书分类号 R392-33 R730.3
Generation and characterization of monoclonal antibodies specific for the oncogene product P185neu/c-erbB-2 by surface epitope masking(SEM)
WANG Chen，LI Yun，LI Ping
（School of Life Science University of Science and Technology of China,Hefei 230027）
Abstract Objective:Surface epitope masking(SEM) is a new approach for selective production of monoclonal angibodies reacting with defined cell surface expressed molecules. Since P185neu/c-erbB-2 protein is an important surface marker of breast cancer and other cancers.This study was to prepare and characterize McAb against P185neu/c-erbB-2 with high specificity and sensitivity by SEM for clinical application.Methods:Using the method of Surface epitope masking(SEM)immunized BALB/C mouse with T6-17 cells which are NIH/3T3 transfected with meu/c-erbB-2 oncogene.Fused the cells with the standard hybridma technique.Performed ELISA screen to test the hybridomas'quality,limited dilution for cell cloning.Results:Three hybridomas which can steadly secret McAb against P185neu/c-erbB-2protein were obtained.The indirect immuno-HRP staining,flow cytometry analysis indicated that these three McAbs bind specifically to the P185 membrane positive cells,but not EGFR membrane positive cells.Western blotting indicated that they all bind specifically to P185 protein.Immunohistochemistry test showed positive staining for the sections of breast cancer tissue specifically.Conclusion:These three McAbs are highly valued for clinic diagnosis and engineering.
Key words neu/c-erbB-2 oncogene P185 Monoclonal antibody(McAb) Surface-epitope masking (SEM)
癌基因neu/c-erbB-2编码的蛋白P185是一个具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶家族中生长因子受体(EGFR)家族。P185在乳腺癌，卵巢癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌等肿瘤组织上的表达情况与肿瘤的分级密切相关，报道最多的是乳腺癌与P185表达的相关性：约有20%～30%的乳腺癌病人的肿瘤组织呈P185高表达，这类病人肿瘤浸润性高，复发可能性大，总的存活期短。临床上可以将P185的表达水平作为一个仅次于淋巴结损伤的独立的预后指标［1，2］。但目前我国使用的抗体诊断试剂均为进口，价格昂贵，来源不稳定。因此，尽快研制并开发出灵敏度高，特异性好的国产抗P185单抗用于常规诊断，无疑具有十分重要的实际意义。本实验室采用细胞表面表位包埋法(Surface-epitope masking，简称SEM法)［3］进行免疫来制备肿瘤细胞表面蛋白P185的单克隆抗体，并对它们的性质进行了研究。
1 材料与方法
1.1 细胞株 SKBR-3为细胞膜上高表达P185的人乳腺癌细胞株；MCF-7，为细胞膜低表达P185的人乳腺癌细胞株。T6-17是NIH/3T3转入neu/c-erbB-2基因而成，其膜表面高表达P185。NE91是由NR6纤维母细胞转入EGFR基因而成，其细胞膜上高表达EGFR。以上几株细胞由美国宾州大学医学院病理和实验医学系Mark Greene教授惠赠。骨髓瘤细胞SP2/0及NIH/3T3细胞来源于中国科学院上海细胞库。
1.2 实验动物 8～12周龄的BALB/C小鼠。由中国科学院上海实验动物中心提供。
1.3 动物免疫与杂交瘤细胞株的制备 采用细胞表面表位包埋法(SEM法)，将T6-17细胞用经NIH/3T3细胞免疫的BALB/C小鼠的抗血清包埋后，对BALB/C小鼠进行免疫，其余按常规细胞融合步骤进行［4］。用ELISA法规定杂交瘤上清，有限稀释法筛选强阳性克隆。
1.4 ELISA法筛选阳性克隆及检测抗体效价［5］ 以细胞裂解液作为包被抗原。收集T6-17细胞和NIH/3T3细胞分别用于阳性和阴性对照，经超声破碎获抗原溶液。再依次加入免疫鼠血清或杂交瘤上清及第二抗体羊抗鼠IgG-HRP(国产，华美公司)，最后加OPD底物显色，OD492nm测定吸收值。
1.5 抗体的纯化和亚类测定 将杂交瘤细胞5×106接种于BALB/C小鼠腹腔制取腹水，然后采用辛酸沉淀杂蛋白和硫酸铵沉淀抗体的两步沉淀法纯化腹水中的抗体。SDS-PAGE检验其纯度，OD280nm测其蛋白浓度。使用上海生物制品所生产的ELISA抗体亚类检测试剂盒对抗体亚类进行测定。
1.6 间接过氧化物酶和免疫荧光法测McAb的细胞染色特性 免疫过氧化物酶染色步骤如下：将已培养2～3 d，细胞密度为50%的盖玻片加固定液(3%甲醛，PBS)室温下固定。滴加50 μl以封闭液稀释的腹水(或纯化的单抗)，湿盒中室温温育1.5 h。洗涤3次，再在盖玻片上滴加50 μl以封闭液1：200稀释的羊抗鼠IgG-HRP，湿盒中室温温育1.5 h。用PBS洗涤3次，稍微晾干，加底物溶液(0.05%DAB，0.03%H2O2，0.05 mol/L Tris-HCl，pH7.6)显色，室温10 min，肉眼可见棕色。用封片液封片，显微镜下观察。
流式细胞仪FACS分析步骤如下：分别收集5×105NIH/3T3和T6-17细胞，FACS缓冲液洗3次，加单抗冰上温育1 h，再加羊抗鼠IgG-FITC荧光二抗温育1 h，洗涤3次后，用0.2%多聚甲醛固定40 min，悬于PBS液中，采用FACS Calibur型流式细胞仪(美国 Becton-Dickinson)分析。
1.7 免疫印迹法(Western Blotting)［6］检测McAb的P185蛋白结合特性 收集生长良好的细胞，加入裂解缓冲液(50 mmol/L pH7.5 Tris-HCl，1% Triton 100，150 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA 1 mmol/L PMSF)裂解，12 000 r/min离心2 min，取上清进行SDS-PAGE 电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜上。加入适当稀释的腹水或纯化的单抗，再加入羊抗鼠IgG-HRP温浴，然后依次加荧光底物A(4 ml 1.5 mol/L Tris-HCl pH9.0，160 μl 6.8 mmol/L Counamic Acid,30 μl 100 mg/ml Luminal)，荧光底物B(4 ml 1.6 mol/L Tris-HCl pH9.0,8 μl 30%H2O2，Sigma公司)。最后X光片感光，显影，定影。
1.8 石蜡切片S-P法免疫组化分析 取安徽医科大学附属医院乳腺癌组织进行免疫组化染色。石蜡切片脱腊至水，PBS洗涤，3%H2O2甲醇室温10 min。PBS洗后用10%的非免疫动物血清室温下10 min，吸去多余液体。加1：600～800稀释单抗(稀释液为0.01 mol/L pH7.4 PBS)37℃过夜，按常规S-P法程序进行免疫组化染色。每次染色用进口商品化的抗P185多克隆抗体做对照，SKBR-3和T6-17以及NIH/3T3和MCF-7、NE91作为细胞对照。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立及稳定性测定 经细胞表面表位包埋法(SEM法)免疫BALB/C小鼠，采用传统的细胞融合技术和ELISA法测定杂交瘤上清，经过4次有限稀释克隆，我们筛选得到了3株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为A18，A21和A22。1年内杂交瘤细胞冻融3次，滴度一直保持在1：1×106～1：1×107。支原体的检测显示此3株杂交瘤均为支原体阴性。
2.2 抗体的纯化和亚类测定 用辛酸沉淀技术，我们得到纯度在90%以上的抗体，电泳结果如图1所示。用ELISA抗体亚类检测试剂盒，检测3株杂交瘤的腹水，单抗亚类均为IgG1。
2.3 间接过氧化物酶染色结果 经过纯化的McAb，以不同的稀释度对甲醛固定的细胞片进行间接过氧化物酶染色，结果如图2所示(抗体浓度为0.2 μg/ml)。细胞膜高表达P185的T6-17细胞为膜阳性染色，而无P185表达的NIH/3T3细胞为膜阴性。
2.4 免疫荧光染色结果 流式细胞术分析这3株杂交瘤上清的免疫荧光染色特性表明它们均与膜高表达P185的T6-17细胞染色，而不与NIH/3T3细胞结合。图3所示为A18单抗流式分析图，A21和A22与A18结果相同(未显示)，这与目前国际公认的标准P185单抗4D5染色效果相同。
1 腹水及各步纯化抗体SDS-PAGE电泳图
Fig.1 Diagram of SDS-PAGE analysis of mouse ascites and McAb products
Note: 1.standard protein marker;2.ascites protein of A21 McAb(11.6 mg/ml);3.the soluble fraction after octanoic acid precipitation;4.precipitates by (NH4)2SO4(8.5 mg/ml);5.precipitates by (NH4)2SO4 with β-ME
图2 间接过氧化物酶细胞染色结果(×180)
Fig.2 Identification of indirect immuno-HRP staining(×180)
Note:A.T6-17 cells；B.NIH/3T3 cells
图3 A18单抗免疫荧光细胞染色结果
Fig.3 FACS analysis for A18 McAb staining for NIH/3T3 and T6-17
图4 免疫印迹结果
Fig.4 Identification of Western Blotting(Concentration of McAb is 0.4 μg/ml)
Note:Lanes1，2，4.lysates of T6-17 cells；3，5.lysates of NIH/3T3 cells；6，8.
lysates of SKBR-3 cells；7，9.lysates f MCF-7cells
图5 A21单抗S-P法免疫组化结果(×320)
Fig.5 Identification of A21 McAb immunohistochemical staining with S-P Haematoxylin(×320)
2.5 免疫印迹结果 如图4所示，在SKBR-3与T6-17细胞裂解液蛋白泳道上分子量为185 kD位置处均有1条明显杂交蛋白带，而对照细胞NIH/3T3和MCF7裂解液无P185杂交蛋白带，说明这3株单抗确实是特异性结合P185蛋白。在T6-17泳道上分子量为110 kD处还有1条蛋白带，经多次测定证明该带为P185蛋白降解的产物。2.6 S-P法免疫组化结果A21染色结果 如图5所示，乳腺癌组织染色呈明显的膜阳性反应，周边良性乳腺组织染色呈阴性，该结果与商品化试剂结果基本一致。
3 讨论
产生针对肿瘤表面抗原的单抗是一个十分困难的过程，Shen等发展的细胞表面包埋法是针对转基因细胞表面的特异基因表达产物制备单克隆抗体的一种新策略［4］。我们采用SEM法的原理，即用NIH/3T3细胞免疫BALB/C小鼠的抗血清去封闭转入erbB-2基因的NIH/3T3细胞即T6-17表面上除P185以外的其他众多抗原，从而提高暴露于小鼠免疫系统的肿瘤抗原P185蛋白的相对浓度和免疫原的相对纯度，降低了筛选工作的难度。本研究是第一例成功使用SEM法制备的肿瘤表面抗原P185的单抗。它不仅解决了纯化的P185蛋白来源困难的问题，并且获得的是针对细胞膜上天然P185蛋白的胞外区的抗体。此法也可用其他类似的细胞表面抗原单抗的制备，尤其适用于细胞表面抗原浓度低，纯化抗原昂贵甚至无法获得纯抗原的情况。成功的SEM法免疫使我们顺利获得了3株能稳定分泌抗肿瘤表面抗原P185单抗的杂交瘤细胞株。免疫荧光染色和Western Blotting的实验结果显示，3株单抗A18，A21，A22均与P185膜蛋白的胞外区特异性结合，而与有40%的同源性的EGFR没有交叉反应，证明此法制备的抗体具有高度的特异性。
纯化后的单抗在0.2 μg/ml浓度下还能有很强的细胞膜着色而背景很低。我们已与安徽省医科大学附属医院合作开展了临床乳腺癌组织病理免疫检测的研究，结果显示我们的单抗与进口的P185单抗和多抗诊断试剂检测的阳性率一致，其中A18的显色背景低，优于进口的检测试剂。目前我国临床上正逐步将检测P185的表达水平作为重要的预后指标，而使用的抗P185单抗依靠进口，我们研制的单抗特异性好，灵敏度高，稳定性好，具有十分良好的应用前景。
最近，我们对该3株单抗抑制乳腺癌细胞SKBR-3生长的活性进行了检测，结果显示，此3株单抗对乳腺癌细胞抑制作用明显，因此它们还将具有应用于临床治疗的前景。
作者简介：王琛，女，26岁，分子生物学专业硕士生；
刘兢，女，58岁，教授，博士生导师，主要从事分子免疫学研究；
姚阳，男，45岁，副主任医师，主要从事临床肿瘤学研究
作者单位：杨正洪（中国科学院上海细胞库，上海200031）
吕源冈（中国科学院上海细胞库，上海200031）
朱德厚（中国科学院上海细胞库，上海200031）
张荣兴（中国科学院上海细胞库，上海200031）
姚阳（安徽医科大学，合肥230022）
吴强（安徽医科大学，合肥230022）
管伟宁（安徽医科大学，合肥230022）
杨枫（安徽医科大学，合肥230022）
参考文献
1，Hynes N E， Stern D F. The biology of erbB-2/neu/HER-2 and its role in cancer.Biochimica et Biophysica Acta,1994；1198:165
2，Ravdin P M，Chamness G C.The c-erbB-2 proto-oncogene as a prognostic ad predictive marker in breast cancer;a paradigm for the development of other micromolecular marker-a review.Gene,1995；159:19
3，Shen R Q, Su Z Z,Olsson C A et al. Surface-epitope masking;a strategy for the development of monoclonal antibodies specific for molecules expressed on the cell surface.J of National Cancer Institute,1994；86:91
4，Hoarlow E,Lane D. Antibodies,a laboratory manual.New York: Cold Spring of Laboratory,1998：148～149，402，409～410
5，McKenzie S J,Marks P J,Lam T et al.Generation and characterizatin of monoclonal antibodies specific for the human neu oncogene product, P185.Oncogene,1989；4:543
6，Beerli R R, Wels W,Hynes N E.Intracellular expression of single chain antibodies reverts erbB-2 transformation.J of Biological Chemistry,1994;269:23931
［收稿1999-10-15］