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再生障碍性贫血免疫致病机制的研究进展
中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 述评
作者：张学光 傅晋翔
单位：张学光（苏州大学生物技术研究所免疫研究室，苏州215007）；傅晋翔（苏州大学生物技术研究所免疫研究室，苏州215007）
张学光，男，1951年生。1986年留学法国，1990年获法国分子生物学国家博士后回国，在苏州医学院创办免疫研究室和生物技术研究所，从事肿瘤免疫和血液免疫方面的基础和应用研究，在生物因子及其受体对人多发性骨髓瘤的生长和调节作用机制，B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗和急性辐射损伤骨髓功能抑制救治方面取得了一系列创新成果，在国内外发表论文100余篇(国外21篇)，其中多篇有较高的引用率，单篇最高引用达190次；先后获得国家杰出人才基金、国防预研重点项目、国际原子能机构重点项目和国家自然科学基金项目多项，获得国家教委科技进步一等奖等省部级科技进步奖6项，现为苏州大学副校长，博士生导师，还担任中国免疫学会理事，江苏省免疫学会筹备组负责人等职。几年来，先后获得全国先进工作者、国家有突出贡献的中青年专家、全国优秀留学回国人员等10余项殊荣。
造血干细胞缺乏导致造血功能衰竭一直被认为是再生障碍性贫血(AA)的主要病理机制。最初应用体外造血细胞集落形成证实AA患者的骨髓中造血细胞明显减少或缺如，CD34+细胞数和集落形成能力均明显低于正常对照组［1］。然而，应用免疫抑制剂如抗胸腺细胞或淋巴细胞球蛋白(ATG或ALG)以及环胞菌素A(CyA)治疗AA，其疗效为50%～80%［2，3］，由此表明既使重型再生障碍性贫血(SAA)，其体内仍有少量造血干细胞的残留，且造血干细胞减少可能是免疫功能异常介导的细胞毒性作用所致［4，5］。近年的研究表明，由T淋巴细胞介导的造血功能抑制在AA的发生、发展中起重要作用，并发现AA的造血微环境中确实存在异常活化具有抑制自身造血和杀伤造血细胞的T细胞及表达NK标志的细胞毒性细胞，鉴此，对AA免疫病理机制的探讨无疑将为AA的有效治疗开拓新的途径。近年来，AA免疫病理研究的焦点集中在：(1)T细胞及其亚群数量的功能改变；(2)Fas/FasL介导细胞凋亡和激活诱导细胞凋亡(AICD)的异常；(3)造血微环境中正性造血和负性调节因子的作用。
1 T淋巴细胞及其亚群数和功能异常在AA中的作用
T淋巴细胞是细胞免疫中的主要效应细胞，也是极不均一的群体，业已有研究发现AA患者不仅存在T细胞数量异常，其功能和表型也有明显改变。Melenhorst等应用定量免疫组化对AA患者骨髓活检细胞进行分析［6］，发现8例患者中的5例骨髓残余造血组织中的T细胞明显增多，他们认为AA患者骨髓中CD3+细胞的增加是淋巴细胞直接浸润或局灶性增生的结果，也是AA造血功能衰竭的原因之一。Maciejewski等检测了33例AA患者(其中23例为SAA)的外周血和骨髓淋巴细胞的表型［7］，结果发现患者骨髓中HLA-DR+CD8+、CD56+标记细胞明显增高，43%的患者外周血和骨髓中CD8+细胞均有增加，28%的患者仅在骨髓中呈现CD8+细胞增多。经免疫抑制治疗缓解后，患者骨髓中HLA-DR+CD8+和CD56+标记细胞数量虽有所下降，但仍高于正常水平。该结果提示与异常免疫有关的细胞毒T淋巴细胞(CTL)或者NK细胞的活化和增生主要局限在骨髓，是造成造血功能异常的主要原因。我们早期研究也发现［8，9］，AA患者CD4/CD8比值倒置，患者外周血CD8+、HLA-DR+和γδT+细胞显著增加，且与免疫抑制剂疗效成正相关，凡CD8+、HLA-DR+和γδT+细胞增多者，免疫抑制剂治疗效果较好。进一步研究证实，患者骨髓AA和外周血中CD8+、CD25+4-1BB+细胞明显增多，双标记分析进一步证实CD3+CD28+、CD8+CD25+细胞显著高于正常对照组，而且表达共刺激分子CD40抗原的细胞也明显升高。由此可见，AA患者体内不但淋巴细胞亚群比例改变，尤其值得注意的是患者体内与淋巴细胞活化第二信号相关的共刺激分子表达异常，提示患者体内多种原因导致淋巴细胞活化信号增加，是自身反应性淋巴细胞产生和异常活化的主要原因之一。AA患者骨髓血体外集落试验也进一步证实，如用免疫磁珠阴性选择法去除骨髓中CD3+细胞，骨髓血集落形成明显增加，由此表明患者骨髓中包含有对自身造血干/祖细胞具有抑制作用的T淋巴细胞。Teramura等观察了ATG治疗前后自身淋巴细胞对造血干细胞的影响［8］。也同样提示异常活化的T淋巴细胞对骨髓造血干/祖细胞毒性作用在AA发病中起重要作用。
Manz等应用RT-PCR研究了6例未经治疗的SAA外周血和骨髓中T淋巴细胞抗原受体(TCR)库中Vβ1-24、J基因和互补决定区3(CDR3)构型的改变［10］，虽然T细胞Vβ基因的取用具有高度多样性，但与正常对照组相比，6例患者中有5例Vβ3、Vβ20、Vβ21和Vβ22的选用率约高3倍。CDR3虽具有多样性的特性，但每个个体均有1～2种占优势且互不相同的J基因重组，主要是Vβ5、Vβ7、Vβ8、Vβ13、Vβ15、Vβ16和Vβ23。他们认为多克隆的T淋巴细胞被高度扩增的寡克隆T淋巴细胞取代，在AA发病起始阶段可能是重要的免疫病理的起因。Nakao等应用PCR-单链构型多态性分析了AA患者骨髓中TCR Vβ的多态性［11，12］，发现骨髓中存在着由于抗原刺激而异常扩增的寡克隆淋巴细胞，并从1例CyA依赖型AA患者骨髓中建立了一株表型为CD4+Vβ21的T淋巴细胞系NT4.2。该株细胞可杀伤自身经EB病毒转化或植物凝血素刺激的淋巴母细胞，对自身及异体CD34+造血细胞也有明显的杀伤作用，但其细胞毒性作用受靶细胞HLA-DR4的限制，体外培养发现NT4.2可强烈抑制表达HLA-DRB1*0405异体CD34+造血细胞的集落形成，其毒性作用可被抗HLA-DR或抗CD3单抗阻断。他们认为这是被一种特定抗原刺激后而扩增的异常淋巴细胞克隆，能识别并杀伤表达该抗原的CD34+的造血细胞，从而导致患者骨髓功能衰竭。
2 细胞凋亡在AA中的作用
CD95/CD95L是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员，通过与仅表达在活化淋巴细胞表面或由存在血浆的可溶性CD95L(sCD95L)相结合后，可诱导细胞发生程序死亡——凋亡。虽然正常个体CD34+细胞也可表达少量Fas抗原，但对Fas诱导的凋亡不敏感。Callera等应用原位末端脱氧脲苷转移酶催化的DNA标记染色法(TUNEL)检查了11例(SAA 4例)AA患者的骨髓活检标本［13］，结果提示AA骨髓造血细胞的凋亡明显增加，达8.19%±1.45%。而正常组仅为2.07%±0.86%。他们认为AA患者骨髓中造血细胞对调亡诱导的敏感性增加，是AA造血干/祖细胞减少的主要原因。Philpott等则用7-氨基actinomycinD(7AAD)标记了46例AA(SAA12例)的骨髓CD34+细胞［14］，与正常骨髓CD34+细胞相比，AA患者的骨髓CD34+细胞对凋亡更为敏感，在发病早期，尤其是SAA，CD34+细胞的Fas抗原表达显著增加，其程度与病情的严重性相关，治疗有效者CD95+细胞有所减少。AA患者骨髓的CD34+细胞Fas抗原表达增多的原因尚未明了，他们认为可能与骨髓局部粒细胞集落刺激因子(G-CSF)分泌过少，负性造血调控因子γ-干扰素(TFN-γ)和/或TNF-α产生过多，上调Fas抗原的表达，而成为CTL或上调表达Fas配体(FasL)的异常活化淋巴细胞增加，Fas受体与配体的相互作用，使骨髓CD34+细胞大量凋亡是导致造血功能衰竭的重要原因。本室对AA患者骨髓和外周血IL-2、IL-2R及sFasL等T淋巴细胞活化产物的分析发现，初治患者绝大部分骨髓和外周血IL-2和sFasL显著升高，尤其是骨髓中升高更为明显，对AA治疗有效患者的动态随访提示，血浆和骨髓中IL-2和sFasL水平变化与病情变化相关，凡有效者两水平下降，复发时再次升高，骨髓和外周血中sFasL含量显著增加，使大量因代偿进入细胞周期的造血干/祖细胞发生凋亡，短期内消耗了大量造血干/祖细胞，从而导致造血功能衰竭。
Callera等进一步观察了AA患者外周血和骨髓T、B淋巴细胞P53、bcl-2、Fas和FasL的表达［15］，发现14例AA患者骨髓和外周血T、B细胞过度表达Fas抗原，其T、B淋巴细胞数也明显减少，而bcl-2和P53的表达与正常组或AA完全缓解(CR)时没有差别［16］。他们提出，AA时CD34+细胞、T和B淋巴细胞表面Fas表达过度是一个普遍现象，由FasL介导的细胞凋亡并不涉及bcl-2和P53。最近对AA、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)和骨髓增生异常综合征(MDS)的研究发现［15，17］，11例PNH的外周血粒细胞和淋巴细胞在体外对自发和抗CD95单抗诱导的细胞凋亡不敏感，其骨髓CD34+细胞对IFN-γ、α-TNF和抗CD95单抗诱导的细胞调亡呈现较强的抵抗，进一步的研究提示这种变化与PNH的异常PIG-A基因无关。13例AA和12例MDS的细胞在体外也有类似结果。他们提出，由于Fas介导的细胞凋亡使大量敏感细胞进入死亡程序，对Fas诱导凋亡不敏感细胞则异常克隆性大量增生，成为骨髓中主要的细胞，这种现象在有骨髓增生异常的疾病如MDS、AA和PNH是普遍存在的，也是导致骨髓造血低下的主要原因。
3 造血调控因子异常在AA中的作用
活化淋巴细胞可产生多种细胞因子，它们在机体的免疫及造血调节中发挥重要作用。不同种类和浓度的细胞因子对处于不同阶段的细胞发挥不同的作用。Stefanie等研究了对正常骨髓细胞增殖、分化有重要作用的干细胞生长因子(SCF)、白介素-3(IL-3)粒-单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和G-CSF等4种造血细胞生长因子(HGFs)对造血干/祖细胞凋亡过程的影响及观察细胞活化后细胞表面Fas的变化［18］。应用流式细胞仪对正常骨髓细胞进行双标记和三标记分析结果提示，CD34+细胞仅有少量的CD95表达，而在较成熟的粒系或红系祖细胞则明显增加，B细胞表面基本不表达该分子，T细胞的CD95为不均质性表达。在体外培养体系中分别加入SCF 200 ng/ml;IL-3 50 U/ml；GM-CSF 5 ng/ml；CSF 1 000 U/ml，培养24 h后，所有细胞CD95表达显著增加，主要是CD34+细胞、较成熟的红系祖细胞和成熟中性粒细胞，而淋巴细胞和粒系祖细胞CD95增加程度与未加HGFs的培养细胞相似，可见HGFs在激活细胞使其增殖分化的同时，上调了CD95的表达。用TUNEL检测细胞凋亡，除SCF外，IL-3、GM-CSF和G-CSF均明显增加细胞调亡的比例，尤其是IL-3，使细胞凋亡从25%上升至44%，但对于静止期细胞无作用。有趣的是G-CSF可减少红系祖细胞的自发性凋亡，但由CD95介导的细胞凋亡却明显增加。这种形式的细胞凋亡称细胞活化诱导的细胞死亡(AICD)。由AICD介导的活化造血干/祖细胞凋亡发生迅速(3～6 h)。他们认为，骨髓中不同细胞系，不同分化阶段的干/祖细胞都通过该路径进行负调节，各种HGFs，尤其是高浓度时将促使造血干/祖细胞进入细胞周期，自然成为由AICD介导的细胞凋亡的靶细胞。我们测定了37例AA患者骨髓及外周血正、负造血调控因子，结果发现，AA是体内的SCF始终无明显变化，而骨髓和外周血中具有多种生物学功能的另一种造血细胞生长因子Flt3配体(FL)含量升高达正常20倍，且骨髓与外周血含量无显著差别，其水平与临床疗效密切相关，治疗有效者FL水平下降，既使是在完全缓解的患者，其血浆或骨髓血含量仍为正常6倍，采用流式细胞双标记的方法，进一步分析细胞浆内及膜表面表达的细胞FL发现AA患者体内异常升高的FL主要来源于T淋巴细胞，我们认为FL含量增加，除骨髓造血功能衰竭的原因外，患者体内免疫功能异常，异常活化的T淋巴细胞大量释放FL，也是造成患者骨髓和外周血中FL显著上升的原因之一，过度升高的FL并不能增加骨髓造血功能，而是导致患者中T淋巴细胞、树突状细胞或自然杀伤细胞的进一步激活及数量增加，从而加重了骨髓造血功能的抑制。这一发现对进一步研究AA的免疫病理及疾病严重程度的评估具有重要的价值，值得进一步探讨。
TNF-γ和TNF-α是二种造血负调节因子，主要由T细胞分泌。应用GM-CFU、BFU-E、长期骨髓细胞培养(LTBMC)以及将TFN-γ基因转入基质细胞的方法，Selleri等分析比较了外源性IFN-γ与基质细胞产生的TFN-γ对骨髓造血细胞体外克隆形成的影响［19］，在LTBMC体系中TNF-γ的有效抑制浓度为1 000 U/ml。在含有TFN-γ转基因基质细胞的培养体系中，GM-CFU和BFU-E的形成显著减少，其上清中IFN-γ的浓度仅为20 U/ml，而该浓度的外源性IFN-γ则对GM-CFU和BF-E克隆形成毫无影响。IFN-γ对造血细胞的作用主要是阻止细胞周期的进行和促进CD34+细胞的凋亡。35例AA外周血单个核细胞(PBMMC)经PHA刺激后，上清中的负性造血因子；巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、转化生长因子-β2(TGF-β2)、TNF-α、IFN-γ均明显增加。而在PHA激发前，AA患者PBMNC培养 与正常PBMNC培养上清的负性和正性造血调控因子无明显差别，应用抗MIP-1α、TNF-α和IFN-γ的特异性单抗可完全中和它们的抑制作用，集落形成分别比原来提高205%、237%和131%。可见AA时上述因子产生过量，也是造成AA造血功能衰竭的原因之一［20］。我们研究同样支持上述结果，AA患者骨髓和外周血TNF-α、IFN-γ，尤其是骨髓水平升高显著，且TNF-α、IFN-γ水平与体外集落和临床疗效呈负相关 。TNF-α、IFN-γ尚可能够刺激骨髓造血细胞，特别是CD34+细胞表达Fas抗原，从而通过Fas/FasL使CD34+细胞发生凋亡。对TNF-α作用机制的研究还发现TNF-α主要是通过其受体(TNFR55、TNFR75)来发挥作用的，尤其是对TNFR55和TNFR75选择性突变小鼠E146K，R32W-S86T和D143F的研究已证实由TNF-α造成的造血细胞凋亡主要是TNFR55的介导，TNFR75协助TNFR55发挥作用，在没有TNFR75的情况下，TNR55的作用明显降低［21］。
白介素-12(IL-12)是自然杀伤细胞和CTL的成熟因子，与IL-2协同刺激细胞毒性淋巴细胞的功能。Mori等在研究由移植物抗宿主病(GVHD)引起的骨髓抑制时发现［22］，在这种主要由免疫反应介导的疾病中，仅在由TH2细胞介导的急性GVHD时发生骨髓抑制，主要原因是由免疫活性细胞产生的多种细胞因子使骨髓造血细胞表达Fas增加。动物实验证明，长期使用IL-12可使实验动物产生类似急性GVHD的症状，通过AICD介导骨髓功能的抑制，全血细胞减少，如给动物注射抗IL-12或抗IFN-γ的中和抗体，则可减少造血细胞Fas的表达，细胞凋亡减少。
在再障的发病过程中，有多种免疫活性细胞或因子的参与。Podesta等在对骨髓移植和免疫抑制治疗后恢复的AA患者的骨髓造血细胞池进行了详细的研究之后指出，即使在SAA患者体内仍有少量造血干/祖细胞残留［23］。因此，对T细胞克隆和亚群的异常、细胞因子及共刺激分子、Fas/FasL和活化细胞介导的细胞凋亡以及免疫遗传等方面的研究，尤其是免疫调节紊乱在AA发病机制中作用的研究，将为AA免疫治疗提供可靠的理论依据，为临床AA的治疗提供了一种新的免疫干预手段。
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［收稿2000-06-30］