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异基因骨髓移植中T细胞表达Ly49A与移植物抗宿主病发生相关
中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 移植免疫学
作者：段连宁 郭坤元 刘明 李玉华
单位：段连宁（第一军医大学珠江医院血液科，广州510282）；郭坤元（第一军医大学珠江医院血液科，广州510282）；刘明（中国人民解放军第157医院放射治疗中心，广州）；李玉华（第一军医大学珠江医院血液科，广州510282）
中国图书分类号 R392.4 R457.7
杀伤细胞抑制性受体(Killer Inhibitory Receptor,KIR)是一种主要表达在NK、T细胞上的抑制性信号传递分子［1］。鼠的KIR分子被称为Ly49家族(Ly49A-I)。在细胞免疫识别阶段，Ly49分子特异地与不同的MHC I分子配体结合，传递抑制性信号，抑制杀伤细胞的早期活化。移植物抗宿主病(GVHD)主要是供者T细胞活化后对宿主细胞和组织的攻击所致。Ly49A/MHC I作为T细胞活化的抑制性信号传递分子，其在GVHD发生中的表达如何将有助于揭示KIR分子参与控制GVHD的可能机制。本文采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)的免疫组织化学法检测正常鼠和半相合异基因骨髓移植后发生GVHD鼠T细胞Ly49A表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 清洁级F1，C57BL/6H-2b×BALB/CH-2d购于第一军医大学清洁动物实验室，普通级C57BL/6H-2b鼠购于中山医科大学动物实验室。
1.1.2 试剂与其它材料 RPMI-1640培养基为Gibco公司产品，4%多聚甲醛，Ly49A单抗A1(BALB/C抗C57BL/6)，美国Yokoyama教授赠送，羊抗鼠IgG二抗为Sigma公司产品，ABC Kit为Vector公司产品，尼龙毛柱(上海产)200目金属网及眼科手术器械。
1.2 方法
1.2.1 GVHD模型的建立 取5 d前开始饮用含庆大霉素(320 mg/L)+红霉素(250 mg/L)的清洁级BAC鼠(F1，BALB/C×57BL/6，H-2b×d，9 w)为受者，经60Co照射9Gy、剂量率为0.5 Gy/min照射。以C57BL/6(H-2b，8 w，♀)为供者。常规制备C57BL/6(H-2b,♂)鼠脾脏T淋巴细胞及骨髓细胞，每只受鼠经尾静脉注射接受供者异基因骨髓细胞(2×107)和脾T淋巴细胞(5×106)。发生GVHD与否的判断：死亡时WBC＜0.5×109 L-1为移植失败；WBC＞1×109 L-1并具有以下症状者为GVHD发生：倦怠、纳差、体重减轻、弓背、脱毛、腹泻甚至死亡［2］。
1.2.2 T细胞的制备 取同期因GVHD濒死的和无GVHD发生鼠，常规制备脾细胞，冲洗时用0.083%的氯化胺溶液溶解红细胞；用尼龙毛柱法收集非粘附细胞(收集率为90%)，即T细胞。
1.2.3 细胞甩片标本的制备 将上述T细胞在4%多聚甲醛中固定4 h后，甩片，滴加0.001%多聚赖氨酸粘片4 h。
1.2.4 ABC方法检测Ly49A表达［3］ 0.01 mol/L PBS(pH7.2)漂洗，加入A1(抗体稀释度为1：5 000)置湿盒中于4℃、48 h；0.01 mol/L PBS漂洗，加Bio-IgG(羊抗鼠二抗稀释度为1：200)置湿盒中于室温3 h，0.01 mol/L BPS漂洗，滴加ABC复合物(1；100)置湿盒中用于室温反应2 h，GDN法(葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺)显色，室温30 min。干燥、脱水、透明，DPX封片后显微镜下观察，呈蓝紫色者为阳性，计200个细胞的阳性百分率。同时用鼠血清稀释液代替A1抗血清，设立空白对照进行上述免疫组织化学步骤。
2 结果
2.1 GVHD实验组小鼠，6/10只于25 d内死于重度GVHD，并经病理证实。4/10只在30 d时仍无GVHD发生。
2.2 空白对照(同时用鼠血清稀释液代替A1抗血清)的Ly49A的表达均为阴性；静止淋巴细胞表达0～5%之间；活化T细胞4%～9%；GVHD发生鼠T细胞Ly49A+细胞为3%；与上述GVHD发生同期的无GVHD发生F1受鼠和第30天仍无GVHD发生受鼠的脾T细胞Ly49A表达为18%。
3 讨论
正常情况下，KIR的存在可能是NK、T细胞不攻击自身组织的重要要素。KIR分子传递的抑制性信号可能是活化T细胞的负调节因素。正是由于Ly49A分子可传递抑制性信号抑制杀伤细胞的早期活化，推测该分子与免疫耐受有关［4，5］。
本文研究的结果推测，通过Ly49A分子传递抑制信号减低供者T细胞对宿主损伤的机制在下调GVHD发生中也起着不可忽视的作用。此外，发生急性重度GVHD鼠的T细胞均低表达Ly49A。可见Ly49A的低表达与GVHD发生有关，即KIR分子识别传递的抑制信号的缺失是导致供者T细胞攻击宿主发生GVHD的重要原因。
由于KIR分子的识别是“丢失自我”(或“不识别即杀伤”)的机制，所以，在H-2b为供者移植给H-2db的受者时，若能提高可识别H-2d或H-2b的KIR分子在供者T细胞的表达，可能是降低急重症GVHD的有效方法。此外，从提高T细胞表达KIR或将KIR基因转移给供者的角度分析的话，在提高临床器官移植或骨髓移植的成功方面应有一定的意义。
本课题为国家自然科学基金资助课题(批准号：39870330)
作者简介：段连宁，男，35岁，主治医师，博士生，主要研究方向为恶性血液病的造血干细胞移植治疗（第一军医大学珠江医院血液科，广州510282）
参考文献
1，Mingari M C,Moretta A,Moretta L.Major histocompatibility complex class 1-specific receptors on human natural killer and T lymphocytes.lmmunol Today,1998;19:153
2，Daniel H F,Kazuhiro K,Rhett S et al.Donor CD4 enriched cells of Th2 cytokine phenotype regulate graft-versus-host disease without lmpairing allogeneic engraftment in sublethally irradiated mice.Blood,1994;84(10)：3540
3，Hsu S M,Raine L,Fang H.Use of avidin-biotin-peroxidase complex(ABC) in immunoperoxidase techniques:a comparison between ABC and unlabeled antibody(PAP) procedures.J Histochem Cytochem,1981;29:577
4，Moretta A.Major histocompatibility complex class 1-specific receptors on human natural killer and T lymphocytes.Immunol Rev,1997;155:105
5，Held W,Cado D,Raulet D H.Transgenic expression of the Ly49A natural killer cell receptor confers class I MHC-specific inhibition and prevents bone marrow allograft rejection.J Exp Med,1996;184:2037
［收稿1999-12-29，修回2000-03-29］