肾病综合征大鼠模型的建立及酶酚酸酯对其作用的实验研究

肾病综合征大鼠模型的建立及酶酚酸酯对其作用的实验研究

中国免疫学杂志 2000年第12期第16卷 临床免疫学

作者：毕黎琦　刘晓敏　何成彦　李颖

单位：毕黎琦（白求恩医科大学第三临床学院肾病科，长春 130031）；刘晓敏（包头医学院附属医院肾病科，包头 014025）；何成彦（白求恩医科大学第三临床学院检验科）；李颖（吉林省干部疗养院，长春 130031）

　　关键词: 酶酚酸酯；肾病综合征；钾通道；肾病综合征动物模型

　　摘　要　目的：研究酶酚酸酯（MMF）对大鼠肾病综合征的治疗作用，为临床应用提供依据。方法：经尾静脉一次性注射阿霉素，构建大鼠肾病综合征动物模型，观察MMF对大鼠肾病综合征血、尿生化指标、淋巴细胞电压依赖性钾通道及肾脏组织学改变的影响，并与强的松进行对照研究。结果：注射阿霉素14 d，大鼠肾病综合征模型建立，模型鼠表现外周T淋巴细胞电压依赖性钾通道电流增强。 MMF治疗可使大鼠尿蛋白和血尿素氮明显下降， 血白蛋白上升， 肾脏病理显示足突无明显融合，疗效明显优于强的松治疗组。结论：在阿霉素诱导的大鼠肾病综合征模型的形成中，细胞免疫参与了其发病。MMF能明显改善模型鼠的肾功能并减轻肾脏组织形态学损害，且疗效优于强的松。

　　中国图书分类号　R453

The experimental study of the effect of mycophenolate mofetil on nephrotic syndrome in rats

BI LI-Qi　LIU Xiao-Min　HE Cheng-Yan

　　（Division of Nephrology, 3rd Teaching Hospital, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031）

　　Abstract　Objective:To investigate the effects of mycophenolate mofetil (MMF) on Adriamycin (ADM) induced nephrotic syndrome (NS) in rats.Methods:It was observed in 50 ADM induced NS rat models (ANS) setup by a single injection of ADM via tail wein, that the changes of blood urea nitrogen, cholesterol, albumin, 24 h urine protein and the current intensity of voltage-dependent K⁺ channel of peripheral T lymphocytes［K(v)］, as well as renal histologic changes. After 10 weeks, different therapies were compared in 5 groups, normal control(A), model control(B), prednison therapy(C), MMF therapy(D) and prednison-MMF combined therapy group(E).AResults:The NS models were setup in rats 14 days after ADM injection. K(v) was increased in model rats and normal in group A and D. The level of BUN and proteinuria in group D was lower than that of group B and C (P＜0.05), serum albumin is higher than B,C and E (P＜0.05). No obvious fusion of foot protrusion was found on pathology in group D.Conclusion:The increased K(v) suggests cellular immunity take part in the development of ANS. MMF was superior than prednison on the therapeutic effect in ANS.

　　Key words　Mycophenolate mofetil　Nephrotic syndrome　Potassium channel　Animal model

　　目前对肾病综合征的治疗，仍以激素及细胞毒药物为主。由于这类药物对人体细胞的作用选择性差，在抑制异常免疫反应的同时，也抑制人体其他细胞的正常功能，因此其毒副作用较大，如引起感染、高血压、无菌性骨坏死、骨髓抑制等。酶酚酸酯（mycophenolate mofetil ，MMF）是一种新型免疫抑制剂，其特点是选择性地抑制鸟嘌呤的经典合成途径，因此对淋巴细胞增殖的抑制作用具有高度选择性，而对肝细胞、骨髓细胞等其他细胞无影响，所以无肝肾毒性及骨髓抑制作用^［1］。酶酚酸酯对狼疮肾炎的治疗作用已经动物实验得到证实^［2］ ，有作者报道用酶酚

　　酸酯成功治疗3例肾病综合征而无明显毒副作用^［3］ ，目前还未见有关酶酚酸酯对肾病综合征治疗作用的完整实验研究报道。

　　本研究通过构建大鼠肾病综合征模型，进行不同药物，不同组别的对照研究，观察酶酚酸酯对大鼠肾病综合征的肾脏组织学改变及实验室指标的影响，为酶酚酸酯用于人类肾病综合征的治疗提供依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　实验动物：健康雄性纯种Wistar大鼠，体重200±10 g；实验用药：盐酸阿霉素（汕头经济特区明治医药有限公司），酶酚酸酯（上海罗氏制药有限公司），强的松（仙居制药有限公司）。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　肾病综合征动物模型的制作　取健康雄性Wistar大鼠， 按Bertain方法 制作肾病综合征模型^［4］， 即非麻醉下按6.5 mg/kg体重1次性尾静脉注射阿霉素（2%阿霉素0.65 ml），对照组同法注射0.65 ml生理盐水。注射后14 d模型形成。

　　1.2.2　实验分组及给药方法　实验分5组，每组10只鼠。按以下药物剂量灌胃给药。A组（正常对照组）；B组（病理模型对照组）；C组〔口服强的松组：4.68 mg/(kg.d)〕；D组〔口服酶酚酸酯组：30 mg/(kg.d)〕；E组（口服强的松及酶酚酸酯组：按C、D组剂量隔日交替给药）。 其中B、C、D、E组均制成肾病综合征模型，C、D、E组均服药14 w。整个实验16 w。

　　1.2.3　观察指标　24 h尿蛋白定量测定采用磺基水杨酸比浊法；血清白蛋白（ALB）、总胆固醇(TCH)、尿素氮(BUN)测定均用7150全自动血液生化分析仪；鼠外周血T淋巴细胞电压依赖性钾通道电流［K(v)］的记录，采用膜片钳方法^［5］。肾脏病理检查：在实验结束时，分别取肾标本作光镜、电镜检查，部分动物在注射阿霉素前和注射后第14、20天分别做肾活检，以确认模型的形成。

　　1.2.4　统计方法　采用组间方差分析，数据用

　　2　结果

　　2.1　肾病综合征动物模型的建立　血、尿生化指标的改变（见表1）。

　　2.2　肾脏组织学改变　A组：光镜下，肾小球无异常改变，电镜下亦无异常。B组：注射ADM 14 d后，光镜下见肾小球内皮细胞及系膜细胞轻度增生；电镜下，可见足突融合及上皮细胞空泡变性（图1）。　　大鼠注射ADM 14 d后，开始出现尿蛋白明显增多，4～5 w达高峰（438.26 mg/24 h）,同时出现低白蛋白血症和下肢浮肿。根据以上结果，结合光镜及电镜改变，证明肾病综合征模型已建立形成。

　　2.3　各组药物治疗结果

　　2.3.1　肾病综合征动物模型建立后，各组药物治疗14 w后血、尿生化指标改变见表2。

　　2.3.2　实验结束时，各组大鼠肾脏组织学改变　A组：光镜及电镜检查均无异常；B组：光镜下，见肾小球毛细血管袢扩张，有较多红细胞积聚，可见细胞成分增生；电镜下，见肾小球基底膜无明显增厚，上皮细胞明显空泡变性，系膜区可见较多电子致密物沉积，足突广泛融合（图2）；C组：光镜下，肾小球损害比B组明显减轻，系膜基质无明显增多，细胞成分比B组明显减少；电镜下，仅见部分足突融合（图3）；D组：光镜下，肾小球基本正常，细胞成分无明显增多，偶见上皮细胞轻微肿胀；电镜下，基底膜结构无异常，足突基本均匀分布（图4、5）；E组：光镜下，细胞成分无明显增多，肾小球损害较B组明显减轻；电镜下，偶见足突融合。

　　2.4　大鼠外周血淋巴细胞电压依赖性钾通道电流强度的改变（见表3）。

　　3　讨论

　　阿霉素（ADM）诱导大鼠肾病综合征（NS）在病理类型上属微小病变型肾病，以后逐渐演变为局灶性肾小球硬化。本实验给大鼠1次性尾静脉注射ADM后成功制成肾病综合征模型，结果与Bertain报道一致^［4］。该动物模型的临床表现和病理变化基本符合人类微小病变型肾病。

表1　两个对照组血、尿生化指标的变化(

　　Tab.1　The changes of serum and urine detection in two control groups (

Group	after ADM injection	24 h urine protein(mg)	ALB(g/L)	TCH(mmol/L)	BUN(mmol/L)
A		6.77±2.61	31.30±2.26	1.63±0.36	7.41±1.81
B	3	11.09±2.921)	29.54±2.98	1.91±0.42	8.18±0.70
	7	42.70±1.672)	22.63±4.371)	2.31±0.511)	24.76±2.132)
	14	118.05±1.332)	15.78±4.622)	1.42±0.71	28.48±3.722)

　　note:1)P＜0.05；2)P＜0.01

表2　各组治疗后尿蛋白及血生化指标的变化(

　　Tab.2　The changes of serum and detection in 5 groups after therapy (

Groups	24 h urine protein(mg)	ALB(mmol/L)	TCH(mmol/L)	BUN(mmol/L)
A	7.48±3.26	31.30±1.84	1.64±0.26	7.45±2.21
B	200.53±14.382)	17.86±4.411)	1.29±0.521)	39.98±8.841)
C	176.31±15.213)，4)	21.43±3.921),3)，4)	1.91±0.451)	15.30±7.011)，3)
D	39.59±27.521)，2)	25.68±2.911)，3)	1.73±0.35	9.81±2.311)，3)
E	57.04±29.381)，2)	22.72±3.491),3)，4)	1.68±0.40	8.36±2.703)

　　note:Compared with group A；1)P＜0.05；2)P＜0.01；Compared with group B；3)P＜0.05；Compared with group D，4)P＜0.05

图1　注射ADM 14 d后 ，电镜下，可见足突融合及肾小球上皮细胞空泡变性(TEM×12 000)

　　Fig.1　14 days after ADM injection,fasion of foot protrusion and vacuolar degeneration can be (TEM×12 000)

图2　B组，注射ADM 14 w，见肾小球基底膜无明显增厚，上皮细胞明显空泡变性，系膜区可见较多电子致密物沉积，足突广泛融合(TEM×7 500)

　　Fig.2　Group B,4 weeks after ADM injection,obvious fusion of footprotrusion and vacuolar degeneration can be found in epithelium.Some electro dense mass deposited in mesovascular ares (TEM×7 500)

图3　C组，肾小球基底膜无明显增厚，部分足突融合(TEM×15 000)

　　Fig.3　Group C,no marked thickening of glomerular basement membrane,only fusion of partial foot protrusion scan be observed (TEM×15 000)

图4　D组，基底膜结构无异常，足突基本均匀分布(TEM×20 000)

　　Fig.4　Group D,No abnormality in basement membrane can be seen.The distribution of foot protrusionis even (TEM×20 000)

图5　D组，基底膜结构无异常，足突基本均匀分布(TEM×6 000)

　　Fig.5　Group D,No abnormalityin basement membrane can be seen.The distribution of foot protrusion is even (TEM×6 000)

表3　各组大鼠外周血淋巴细胞电压依赖性钾通道电流强度的变化(

　　Tab.3　The changes of the cureent intensity of voltage-dependent K⁺ channel of ratperipheral T lymphocytes

Group	The cruuent intensity of volatge-dependent 　　K+ chanel of lymphocytes(pA)
A	246.9±28.3
B	490.3±22.11)
C	438.2±19.61)
D	208.3±24.5

　　note:Compared with group A　　ADM肾病的发病机制，1987年，Baker等发现ADM肾病鼠肾小球内ATP酶活性下降，可被超氧化物歧化酶（SOD）阻断，认为ADM肾病是由活性氧族介导的疾病，引起细胞损伤；同时活性氧还能趋化中性粒细胞，刺激肾小球合成前列腺素及血栓素，最终破坏肾小球滤过膜的结构和功能，使上皮细胞足突融合导致足突裂隙及其隔膜消失，引起孔径屏障及电荷屏障损伤^［6,7］，而引起蛋白尿。过去的研究都认为ADM肾病是非免疫机制所介导，但在ADM肾病形成过程中，除氧化损伤外，细胞免疫可能也参与了发病。因为活性氧可以间接趋化中性粒细胞，中性粒细胞通过粘附及吞噬免疫反应物，引起细胞活化，释放一系列炎症介质，导致肾小球损害。这与人类NS发病机制相似。另外，本研究首次发现ADM诱导的NS大鼠外周T淋巴细胞钾离子通道电流增强，而淋巴细胞膜上的钾离子通道的主要作用是维持细胞的静息电位，调节细胞体积和参与淋巴细胞的激活，丝裂原刺激淋巴细胞增殖时，膜上电压依赖性钾通道密度明显增加，使电流增强。本研究结果表明，模型鼠体内淋巴细胞作用增强，f提示在ADM诱导大鼠NS时，细胞免疫可能参与了发病。经MMF免疫抑制治疗的大鼠此电流恢复正常，而强的松治疗组则无明显改善。说明MMF可以抑制淋巴细胞活化过程，其作用优于强的松。

　　MMF与硫唑嘌呤虽均为细胞代谢抑制剂，通过抑制细胞鸟嘌呤核苷酸（GTP）的合成，进而抑制细胞生长。但前者只可逆性地抑制GTP经典合成途径，对补救途径无影响。而抗原激活的T、B淋巴细胞高度依赖鸟嘌呤的经典合成途径。因此，MMF具有选择性抗淋巴细胞增生作用，通过抑制淋巴因子及细胞表面粘附分子的作用，阻止中性粒细胞、淋巴及单核细胞在炎症部位的聚集，发挥抗炎效应。因MMF作用有高度选择性，对增生活跃的肝细胞、骨髓细胞等无影响，所以无肝肾毒性及骨髓抑制作用。

　　经用MMF、强的松、MMF和强的松联合用药3种方法治疗，3组尿蛋白量均较模型对照组下降，以MMF治疗组降低明显。经强的松治疗的大鼠尿蛋白量先下降，治疗6 w后又开始升高，大鼠的症状也是治疗早期有所改善，治疗1个半月后又出现下肢浮肿，足部溃烂，考虑与激素的副作用有关，说明激素的短期疗效尚可，长期疗效不稳定，而MMF疗效稳定。用MMF成功治疗肾小球性疾病6例的报道与本实验结果一致^［3］。且MMF升高血清白蛋白的作用亦优于强的松治疗组。模型对照组肾功能逐渐恶化，而经治疗的3组肾功能均有所改善，以MMF及MMF和强的松联合治疗组明显，说明MMF可有效改善肾功能。

　　经光镜、电镜检查，3个治疗组的肾脏病理损害均较模型对照组有不同程度的减轻，说明3种治疗均有效。其中MMF组肾病理改变最轻微，说明MMF可以改善ADM导致的肾脏组织损害。

　　综上所述：①本研究在国内外首次将MMF用于大鼠NS的治疗，并且发现MMF明显改善大鼠的一般状态、降低尿蛋白，增加血清白蛋白，改善肾功能和肾脏组织形态损害，且疗效优于强的松组。②用膜片钳技术，在国内外首次检测了NS大鼠外周T淋巴细胞电压依赖性钾通道电流强度，发现此电流增强，提示在ADM肾病发病过程中，细胞免疫参与了发病。经MMF治疗后NS大鼠T淋巴细胞电压依赖性钾通道电流恢复正常，为MMF用于临床治疗NS患者提供了实验依据。

　　作者简介：毕黎琦，女，42岁，教授，博士生导师，主要从事肾病研究

参考文献

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　　2，Damela C, Marina M. Mycophenolate mofetil limits renal damage and prolongs life in murine lupus autoimmune disease. Kidney International,1997；51:1583

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　　4，Bertain T, Andreina P, Bid D et al. Adriamycin-induced nephrotic syndrome. Lab Invest, 1982；46:16

　　5，Richard lewis. Potassium and calcium channels in lymphocytes. Annu Rev Immunol， 1995；13:623

　　6，Wilson C B. The renal response to immunologic injury. In:Brenner B M, Rector F C. The kidney. 4th ed. Philiadephia： WB Saunders,1991：1062-1081

　　7，董德长.内科各系统疾病与肾脏.北京：人民卫生出版社，1986：15

收稿2000-06-27

　　修回2000-09-10