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关键词：烧伤；IgA；白色念珠菌；细菌定植；小鼠
白色念珠菌是烧伤后常见的条件致病真菌，以往研究证实，烧伤后早期肠内即有真菌的优势定植［1］。在局部肠内屏障中，粘膜免疫抗体屏障是支柱之一，过去许多文献证实烧伤后早期局部抗体IgA有明显下降［2］，但处于检测总IgA水平阶段。目前认为，不同的抗原种类诱生的IgA抗体特异性不同［3］。深入研究烧伤后肠腔内特异抗白念菌IgA水平变化与白念菌定植与粘附的相互关系，对于阐明局部抗体变化如何导致肠粘膜屏障功能下降，显然十分必要。本研究利用无特殊病原菌小鼠白念菌定植模型，对烧伤后早期局部抗体变化与白念菌定植粘附的关系进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物分组、给菌及致伤
无特殊病原菌(Special pathogene free,SPF)小鼠87只，本校动物中心提供，5周龄，(20±2)g。设正常对照组(Control)，烧伤前组(Pre-burn)，烧伤组(Post-burn)，后两组动物给菌：白色念珠菌标准株(cmcc44104)为本所保存菌株，在沙氏平板上增菌，生理盐水冲洗收集，调菌悬液至1.5×109 cfu/ml，每只动物经口喂入0.5 ml菌悬液，隔离饲养。 在给菌后14 d时，烧伤组动物背部剃毛后经3%凝固汽油烧7 s，致以20%烧伤总面积(Total b urn surface area,TBSA)Ⅲ度烧伤。活杀：脱颈处死对照组及烧伤前组动物；烧伤组于烧伤后1、2、3 d处死。
1.2 取材
动物活杀后，无菌取盲肠、末段回肠。其余取剩余全段小肠，在4°C下，平铺于滤纸上，纵行剖开，充分清洗内容物，用玻片刮取粘液约0.1 ml，-20°C保存。
1.3 白色念珠菌选择培养
盲肠内白念菌总数 取完整盲肠，称重后置于5 ml生理盐水匀浆，系列稀释后取0.1 ml均匀涂布于沙氏选择平板(内含高浓度伊米配能)，37°C下培养72 h，计数阳性菌落，并 换算出每克组织的菌落数。
肠粘膜表面粘附数量［4］ 取末端回肠，经无菌程序及15 ml灭菌生理盐水彻 底冲洗肠腔，称重后入5 ml生理盐水混匀，取0.1 ml均匀涂布于沙氏选择平板表面，37°C 培养72 h，计数阳性菌落，并换算出组织中的菌落数。
1.4 肠粘液中特异抗白念菌IgA抗体的检测［5］
取肠粘液，用0.5 ml PBS(pH 7.2, 0.01 mol/L)充分混匀，离心5 000 r/min，5 min， 取上清待测。
白色念珠菌经10%甲醛缓冲液固定过夜，次日用生理盐水充分洗涤。调菌液至3.0×108/ml，每孔100 μl包被96孔酶联板，4°C，72 h倾去，PBS洗3次。用0.5% bSA PBS液封闭 30 min，倾去后每孔直接加入100 μl粘液上清，37°C，1 h。PBS洗涤3次，加入HRP标记抗 鼠IgA(Sigma公司，1∶250)，27°C，1 h。OPD显色半小时，2 mol/L H2SO4 1滴终止， 492 nm比色读取D492值。0.5% BSA为阴性对照。
特异IgA相对定量：取经预实验已测其阳性的10只小鼠粘液上清，做1∶1，1∶2，1∶8，1∶16稀释，以1∶1时设定为1 000 U/ml。以上设定标准品与样本同时测定。制定标准曲线。
粘液上清同时测总蛋白含量。
1.5 统计学处理
采用第四军医大学SPLM软件作方差分析。
2 结果
2.1 烧伤后白念菌数量变化
盲肠内白念菌总数在伤后变化较大，伤后24 h明显增加，但至伤后2、3 d就基本恢复正 常。而粘附至肠粘膜表面的白念菌数量以伤后2 d最高，伤后3 d略有下降，但仍高于正常水 平，见表1。
2.2 伤后特异抗白念菌IgA的变化
定植白念菌后特异IgA水平明显升高，但烧伤后其含量有所降低，以伤后2 d最明显， 仅为伤前平均水平的一半左右，见表2。
表1 白色念珠菌数量变化
tab 1 Change of the amount of camdida albicans (cfu/g)
| Cecum content (×105) | Adherence to intes tine | |
| Control (n=19) | 0 | 0 |
| Pre-burn (n=25) | 3.23±7.63 |
231.77±321.64 |
| Post-burn 1 d (n=19) | 14.77±38.71△ | 270.57±313. 35 |
| 2 d (n=12) | 0.23±0.16 | 1663.58±2559.00△ |
| 3 d (n=12) | 0.26±0.31 | 449.33±353.22△ |
△:P＜ 0.05 vs pre-burn
表2 肠腔内抗白色念珠菌特异IgA水平
tab 2 Specific IgA to candida in intestine
| Postive rate | IgA contents (U/mg) | |
| Control (n=19) |
6(32%) |
18.63±6.87 |
| Pre-burn (n=25) | 10(40%) | 69.37±25.37△ |
| Post-burn 1 d (n=19) | 9(47%) | 48.84±26.47△ ※ |
| 2 d (n=12) | 9(57%) | 38.22±23.57△ ※ |
| 3 d (n=12) | 5(42%) | 52.64±37.35△ ※ |
△：P＜ 0.05 vs control;※：P＜ 0.05 vs pre-burn 3 讨论
本研究利用SPF动物模型及选择培养技术，可以直接观察肠内白色念珠菌的粘附数量变化。S PF动物肠内本无真菌，给人外源性白色念珠菌后，真菌选择培养的结果直接反映白色念珠菌数量，这样优点有：①避免了普通动物可能携带的念珠菌对结果的影响；②可长期观察所给入白念菌的定植变化，而同位素和荧光标记菌的观察则有时限性。
烧伤特异抗白念菌IgA水平下降与肠粘膜表面白念菌数量密切相关：伤后1 d，特异IgA与伤前相比，略有下降，此时粘膜表面粘附菌量与伤前无明显差别；伤后2 d，特异IgA水平 显著下降，粘附菌量也远高于伤前水平；伤后3 d，特异IgA水平略有回升，粘附菌量亦降至 (449.33±353.22)cfu/g。而盲肠内总菌量由粘附粘膜表面菌量和肠内容物中菌量构成，伤后总菌量亦有变化，以伤后1 d为最高，伤后2、3 d已与正常无明显差别。说明总菌量的变化与 特异IgA以及其它一些因素有关，如肠蠕动情况。伤后第1天，肠内白念菌数量虽然较多，但此时肠内特异IgA水平尚处于较高水平，因此粘附至肠粘膜表面的白念菌数量并无明显增多；而伤后2 d IgA水平下降明显，粘附菌量显著增加；由此可见，特异抗白念菌IgA在抑制白念菌粘附肠粘膜方面起着重要作用。
基金项目：全军“九五”攻关项目(96L042)
作者简介：白晓东(1969-)，男，山西省太原市人，博士，主治医师，主要从事烧伤感染方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754149-8041白晓东（第三军医大学附属西南医院烧伤研究所)
刘贤华（预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆4000 38)
肖光夏（第三军医大学附属 西南医院烧伤研究所）
参考文献：
［1］陈 军，张雅萍，肖光夏，等.双歧杆菌制剂防治烧伤鼠肠源性感染的初步研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，1996，16(增刊)：62-64.
［2］ 白晓东，粟永萍，刘贤华.严重烧伤后肠粘液成份变化与肠源性感染的关系［ j］.中华整形烧伤外科杂志，1996，12(2)：90-92.
［3］ Lomm M E. Interaction of antigens and antibodys at mucosal surface ［J］. annu Rev Microbiol,1997,51:311-320.
［4］ 郭宁如，沈永军，吕桂霞，等.不同免疫状态下的白念珠菌对小鼠肠粘膜的粘附及影响［J］.中华皮肤科杂志，1994，27(2)：86-87.
［5］ Maeve M C. Simont T, Stephen J C. Immunogolbulin A, IgA1, and IgA2 antibodies to candida albican in whole and parotid saliva in human inmmuno-defi ciency virus infection and AIDS［J］. Infection Immun,1994,62(3):892-894.