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Expression of drug-resistance genes associated marker in carcinoma
CHEN Gaoming CHENG Guojun, et al.
（North Tai-ping Hospital, Beijing 100850, China）
LI Chunhai
（Department of Tumor Molecular Biology）
【Abstract】Objective To detect the expression of glutathione-S-transferase-π(GST-π)，multidrug resistance gene(MDR1)，multidrug resistance-associated protein (MRP) and lung resistance protein (LRP) in clinical carcinoma (include breast carcinoma, lung carcinoma, esophageal carcinoma and ovarian carcinoma) by RT-PCR.Methods The gene expression of GST-π, MDR1, MRP, and LRP was determined by RT-PCR. The plasma level of GST-π was determined by radioimmunoassay.Results The expression rate of GST-π, MDR1, MRP, and LRP was over 30% in detectable carcinomas. The highest expression rate was found in different carcinomas: 80% for GST-π in esophageal carcinoma, 94.7% for MDR1 in breast carcinoma, and 87.8% for LRP in ovarian carcinoma. The coexpression rate of drug-resistance associated marker was higher than that of expression (P＜0.05). The non-responder to platium based combination chemotherapy showed a higher rate of MRP, GST-π and (or) MDR1, LRP coexpression than the responder (P＜0.01) did. The plasma level of GST-π was higher after chemotherapy than before chemotherapy.Conclusions GST-π MDR1, MRP, and LRP are major factors associated with drug-resistance. Coexpression is one of major featues of drug-resistance-associated markers expression. Combined drug-resistance-associated markers may help judge the changes after chemotherapy.
【Key words】Tumor markers biological; Ovarian neoplasms; Drug-resistance, multiple; Gene, structural, neoplasm
化学药物疗法是治疗恶性肿瘤的主要手段之一。对于化疗药物原发性和继发性的耐受，是大多数肿瘤化疗失败的主要原因。从目前的研究成果来看，肿瘤耐药异常复杂，是多基因，多步骤综合作用的结果。耐药相关标志主要包括多药耐药基因（MDR1），多药耐药相关蛋白基因(MRP)，肺耐药相关蛋白基因（LRP），谷胱苷肽-S转移酶(GST-π)，P450和凋亡相关基因如P53和Bcl-2等。我们用聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了多种耐药相关标志在食管癌，肺癌，乳腺癌和卵巢癌中的mRNA表达水平和共表达情况，并进一步研究以铂剂为主化疗的卵巢癌，探讨了耐药相关标志和疗效的关系。
材料和方法
1.标本：均为术中取材的癌及癌旁组织标本。食管癌标本30份由河南医科大学提供，乳腺癌标本148份由天津肿瘤医院提供，卵巢癌标本41份来自解放军总医院妇产科，肺癌标本51份由本室留取。卵巢癌术前化疗采用以铂剂为主的化疗方案，一般为6～13个疗程，用CA125血浆水平下降和肿瘤缩小来判断短期疗效。所有样本均于术后0.5 h内处理，置液氮中保存。
2.试剂：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，Taq DNA聚合酶和探针标记试剂盒购自Promega公司，其他试剂均为国产分析纯。
3.方法：RT-PCR方法见文献［1］。引物用计算机辅助设计，为消除基因组DNA污染的影响，引物分别设计在不同的外显子上。GST-π，MDR1，MRP，LRP及内参基因β-actin的引物序列见表1。
表1 GST-π，MDR1，MRP，LRP及内参基因
β-actin的引物序列
| 耐药相关
标志基因 |
引物序列 | 产物大
小(bp) |
基因库
接受号 |
| GST-π | 5′-CAG GAG GGC TCA CTC AAA-3′ | 350 | X06547 |
| 3′-GAT CAG CAG CAA GTC CAG CAG-5′ | |||
| MDR1 | 5′-GTA CCC ATC ATT GCA ATA GC-3′ | 167 | NM-00927 |
| 3′-CTG AGT CCT CGT CTT CAA AC-5′ | |||
| MRP | 5′-ATG GAC TAC ACA AGG GTG ATGC-3′ | 337 | L05628 |
| 3′-TCC GCA TCT CTG TCT CTG G-5′ | |||
| LRP | 5′-GAG CAG TTC ACA GTG TTG TCC-3′ | 342 | X79882 |
| 3′-AAA GCC AAA GAC AGC AGT GCG-5′ | |||
| β-actin | 5′-CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA-3′ | 234 | M10277 |
| 3′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT AC-5′ | |||
| β-actin | 5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3′ | 621 | M10277 |
| 3′-TCA TAC TGC TCA GGC CGG GGA-5′ |
结果判断：取扩增产物10 μl，行2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色。靶基因和内参基因β-actin均见特征性条带为阳性，只见内参基因条带为阴性，未见条带说明RNA降解，不计算结果。定量结果用Kodak凝胶成像系统处理。GST-π放射免疫分析见文献［2］。
4.统计学分析：采用Fisher精确性检验，Spearman相关分析，成组t检验(统计软件使用SPSS7.5软件包)。
结果
一、定量PCR方法的建立及质量控制
以阳性质粒作为阳性对照,几例样本的PCR扩增结果见图1。GST-π、MDR1、MRP、LRP和β-actin分别得到350、167、337、342和234 bp、621 bp左右的条带，与所设计的扩增片段大小相符。阴性对照未见任何扩增条带，说明上述条带为特异性扩增产物。
图1 RT-PCR测定肿瘤耐药相关标志基因表达结果
定量PCR产物的检测终点必须落在指数增长区内，并且目标基因和参照基因必须有相似的动力学特征。图2显示了建立定量MDR1的动力学分析结果，示β-actin 2种不同扩增片段产物和MDR1在22～30个循环内均呈指数扩增，但β-actin 234 bp扩增片段和MDR1有更相似的动力学特征，所以选择β-actin 234 bp扩增片段和MDR1配对检测MDR1的表达水平。
| 图2 MDR1定量PCR的动力学分析
二、耐药相关标志基因在肿瘤组织中的表达和共表达 我们应用RT-PCR技术检测了乳腺癌，卵巢癌，食管癌和肺癌组织共计270例标本中GST-π，MRP，MDR1和LRP的基因表达水平，以耐药相关标志基因与内参照基因β-actin的吸光度比值计算。表2显示耐药相关基因标志在肿瘤中的表达情况。从表2可知4种耐药相关标志在肿瘤中表达普遍，阳性率均在30%以上。但其在不同肿瘤中阳性率不一样，在食管癌中GST-π阳性率最高，而在乳腺癌中MDR1阳性率最高，卵巢癌则以LRP表达为主，MDR1在不同肿瘤中表达阳性率可相差3倍。 表2 GST-π、MDR1、MRP、LRP在各肿瘤组织中的阳性率(%)及基因表达水平 |
| 项目 | 标本 | 肿瘤组织 | 癌旁组织 | ||||||
| 总例数 | 阳性 | 阳性率 | 表达水平 | 总例数 | 阳性 | 阳性率 | 表达水平 | ||
| GST-π | 食管癌 |
30 |
24 |
80.0 |
1.98±0.76 | 30 | 31 | 86.6 | 1.02±0.58 |
| 肺癌 | 51 | 26 | 51.0 | N | 51 | 10 | 19.6 | N | |
| 乳腺癌 | 148 | 108 | 72.9 | 0.63±0.15 | 6 | 0 | 0 | 0 | |
| 卵巢癌 | 41 | 21 | 51.2 | N | 25 | 3 | 12.0 | N | |
| MRP | 乳腺癌 | 55 | 42 | 76.4 | 0.31±0.06 | N | N | N | N |
| 卵巢癌 | 41 | 22 | 53.7 | N | 25 | 3 | 12.0 | N | |
| MDR1 | 乳腺癌 | 57 | 54 | 94.7 | 1.62±0.20 | N | N | N | N |
| 食管癌 | 30 | 10 | 33.3 | N | 30 | 4 | 13.3 | N | |
| 肺癌 | 51 | 22 | 43.1 | N | N | N | N | N | |
| 卵巢癌 | 41 | 12 | 29.3 | N | 25 | 0 | 0.0 | 0 | |
| LRP | 卵巢癌 | 41 | 35 | 87.8 | 0.35±0.10 | 25 | 13 | 52．0 | 0.20±0.21 |
注：表达水平为耐药相关标志基因和内参照基因β-actin吸光度比值(下表同)，N：表示结果未统计
在41例4项耐药相关标志均检测的乳腺癌及卵巢癌组织中，MDR1在乳腺癌和卵巢癌单独表达的阳性率分别为14.6%和4.9%，2个标志共表达阳性率分别为39.0%和78.0%，3个标志共表达的阳性率分别为46.4%和17.1%，结果见表3。从表3可以看出，在乳腺癌和卵巢癌中耐药相关标志共表达率均非常高（Fisher精确性检验，P＜0.05）。2种肿瘤的共表达现象有不同的特点，在乳腺癌中MRP和GST-π的表达常伴有MDR1表达，未见在MDR1阴性情况下MRP和GST-π共表达现象，而在卵巢癌中MRP和GST-π共表达情况下未见MDR1的表达。
表3 41例乳腺癌和卵巢癌MDR1、MRP和GST-π的共表达关系
| 阳性表达基因
项目 |
共表达率（%） | |
| 乳腺癌 | 卵巢癌 | |
| MDR1 MRP GST-π |
46.4△ |
17.1 |
| MDR1 MRP | 24.4△ | 26.8△ |
| MDR1 GST-π | 14.6△ | 19.5△ |
| MRP GST-π | 0.0 | 31.7△ |
| MDR1 | 14.6 | 4.9 |
| MRP | 0.0 | 0.0 |
| GST-π | 0.0 | 0.0 |
| 总计 | 100.0 | 100.0 |
注：和其他组比较：△P＜0.05 三、卵巢癌耐药相关标志在化疗监测中的应用
卵巢癌患者化疗方案均为铂剂为主的综合化疗方案，用CA125血浆水平和影像学指标判断短期疗效，从耐药相关标志表达水平和共表达率两方面分析耐药相关标志和疗效的关系。
1.耐药相关标志表达水平和临床术前化疗的关系：55例卵巢癌患者中有36例接受术前化疗，MRP，LRP，GST-π及MDR1在2组中表达的阳性率差异无显著意义（P＞0.05，χ2检验）。术前化疗组(36例)LRP平均表达水平为0.46±0.08，高于术前未化疗组(19例)的平均表达水平(0.35±0.10，P＜0.05，成组t检验）。其他耐药相关标志基因表达水平两组间差异未见显著意义。监测17例接受术前化疗的卵巢癌患者发现，GST-π血浆水平与化疗疗效有关。治疗后GST-π血浆水平［(13.66±1.53) μg/L］较治疗前［（17.93±1.13）μg/L］有明显的下降(P＜0.01)。一般化疗无效者疗前GST-π水平较高，化疗前后GST-π水平变化也不大。
2.耐药相关标志共表达与化疗疗效的关系：36例接受术前化疗的卵巢癌患者，耐药相关标志共表达情况和化疗疗效密切相关（表4）。由表4知，MRP和GST-π、MDR1联合检测在卵巢癌疗效判断上有较大价值（Fisher精确性检验，P＜0.01）。MRP，GST-π联合检测LRP也有一定价值（Fisher精确性检验，P＜0.05）。GST-π，MDR1，MRP和LRP 4种标志联合检测由于例数较少，结果还很难判断。
表4 卵巢癌耐药相关标志共表达和化疗疗效关系
| 阳性表达
项目 |
例数 | 疗效
明显 |
疗效
不明显 |
P值 |
| MDR1，MRP |
10 |
1 |
9 |
＜0.01 |
| MDR1，GST-π | 8 | 2 | 6 | ＞0.05 |
| MRP，GST-π | 13 | 2 | 11 | ＜0.01 |
| MDR1，MRP，GST-π | 7 | 2 | 5 | ＞0.05 |
| GST-π，MRP，LRP | 13 | 3 | 10 | ＜0.05 |
| GST-π，MDR1，MRP，LRP | 7 | 2 | 5 | ＞0.05 |
讨论
目前，研究肿瘤耐药相关标志的方法主要有免疫组化技术，分子杂交技术和PCR技术。我们曾用免疫组化从蛋白水平检测GST-π与肺癌化疗的相关性［3］，一般阳性率高者化疗疗效不明显。我们采用了共扩增RT-PCR技术，选择在大多数细胞膜上都表达的β-actin作内参照。内参照可以方便排除假阴性结果，只有靶基因条带和β-actin同时出现才能判为阳性，若标本的β-actin条带未能扩增出来则说明RNA降解。内参照也可方便地用于定量，只要优化测定体系，在指数扩增范围内用比值便可代表基因表达的相对水平［1］。同时，定量PCR的质量控制也是非常重要的。我们以稳定的构建质粒作质控物，采用以上下控制线定值的X控制图取得了较好的质控效果。
耐药的产生往往涉及许多耐药相关标志的表达。自从MDR1发现以来，耐药相关标志不断被发现，许多已被成功地用于化疗过程的监测及疗效的判断［4-6］。耐药相关标志和肿瘤标志既有相同点又有不同点，相同点在于二者一般在正常组织和肿瘤组织均有表达，只是表达量不同；不同点在于耐药相关标志还与治疗药物或化疗方案密切相关，这使耐药相关标志的表达情况更为复杂。从本研究来看，GST-π，MDR1，MRP，LRP在肿瘤中基因水平的表达有3个特点。(1)表达普遍，肿瘤组织阳性率均在30%以上。(2)不同肿瘤类型有优势表达的耐药相关标志，如在食管癌GST-π表达率高，在乳腺癌MDR1表达率高，而卵巢癌的LRP表达率高。(3)同一种耐药相关标志在不同肿瘤组织表达程度差别较大，以MDR1为例，阳性率可相差3倍。
耐药相关标志的共表达率很高，并且不同类型耐药标志表达谱差异很大。近期的研究发现，共表达在耐药中是普遍存在的，共表达是耐药相关标志受共同因子调控的证据［7］。Vanhoefer等［8］认为，在耐药产生的早期阶段，GST-π非特异性的结合作用可协助药物通过P-糖蛋白形成的药物排流泵。我们以前的研究结果提示，GST-π、MRP在乳腺癌中共表达的存在［9］。Kim等［10］发现GST-π，MDR1，MRP和TOPⅡ在肾癌中表达水平存在正相关。和肿瘤标志一样，联合检测耐药相关标志可提高判断化疗疗效的符合率。但对不同类型的肿瘤与化疗方案，应该联合检测不同的耐药标志。另外，耐药相关标志的共表达也提示临床耐药逆转应考虑到多个基因的作用与表达，这也为耐药逆转提出了一个新课题。
耐药相关标志的基因或蛋白水平的表达与化疗疗效也有一定关系。本文结果提示，LRP基因水平和GST-π血浆水平均有判断以铂剂为主的化疗疗效的价值。由于实体瘤标本不能多次留取，要监测耐药进程非常困难。我们先前在肺癌中检测的结果表明，化疗疗效和治疗前GST-π血浆水平有一定的相关性(P＜0.05)［11］。本次在卵巢癌中的检测结果再次提示，GST-π血浆水平对监测化疗效果和耐药进程有潜在的价值。研究实体瘤化疗动态监测的指标将是以后的方向之一。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370789)
通信作者：李春海（100850 北京，军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物学研究室）
参考文献
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3 冯久贤，王恩忠，李春海，等.谷胱苷肽S转移酶在耐药非小细胞肺癌中的表达.中华医学杂志，1996，76：234-235.
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10 Kim WJ, Kakehi Y, Kinoshita H, et al.Expression patterns of multidrug-resistance (MDR1), multidrug resistance-associated protein (MRP), glutathione-S-transferase-π and topoisomerase Ⅱ（TOPOⅡ）gene in renal cell carcinomas and normal kidney. J Urol, 1996,156:506-511.
11 戴广海，石廷章，李春海.肺癌患者血浆GST-π水平测定及其临床意义.中华肿瘤杂志，1997，19:357-359.