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【摘要】 ［目的］研究RFC(还原叶酸载体)、GST-π（谷胱甘肽S转移酶π）、DHFR（二氢叶酸还原酶） mRNA在人骨肉瘤U2-OS细胞系及人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中的表达差异，并探讨其在人骨肉瘤MTX化疗耐药中的意义。［方法］采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的方法，诱导人骨肉瘤细胞系U2-OS，并建立耐MTX细胞系（U2-OS/R1-R3），利用荧光定量PCR技术在mRNA 水平检测RFC、GST-π、DHFR在U2-OS及（U2-OS/R1-R3）中的表达。［结果］本试验成功建立三株人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中，荧光定量PCR结果显示MTX耐药与DHFRmRNA表达增加有关，与RFCmRNA的表达降低有关，与 GST-πmRNA的表达增加有关。［结论］本试验在基因水平探讨人骨肉瘤细胞MTX化疗耐药机制， DHFR、GST-π基因表达的增加及RFC基因表达的降低参与了人骨肉瘤细胞的MTX耐药，为临床探索骨肉瘤患者的MTX耐药机制提供了重要的依据，为临床筛选MTX化疗不敏感患者提供重要的依据。
【关键词】 实时荧光定量PCR； 甲氨喋呤（MTX） 还原叶酸载体（RFC）； 二氢叶酸还原酶（DHFR）； 谷胱甘肽S转移酶（GST-π）
Detection of RFC，DHFR and GST-π expression in human osteosarcoma cell line with MTX-resistence by FQ-PCR∥YU Ming-dong, LI Shu-zhong. Spine Surgery Department of the Affiliated Hospital of Medical College ,Qingdao University，Qingdao,Shandong 266003, China
Abstract: ［Objective］To study the difference in expression of RFC, GST-π, DHFRmRNA between human osteosarcoma U2-OS cell line and the MTX-resisitant variants U2-OS/R1-R3, and to investigate the significance in MTX resistance for human osteosarcoma. ［Methods］Three resistant MTX human osteosarcoma cell lines were established by pulse exposure parental cell line(U2-OS) in gradually increased dose of MTX . The expression of RFC，GST-π，DHFRmRNA were assayed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).［Results］Three MTX-resistant variants(U2-OS/R1-R3) were successfully established , the results of the FQ-PCR revealed that the MTX resistance was associated with the decreased expression of the RFC mRNA and increased expression of DHFR mRNA and GST-π mRNA.［Conclusion］The author investigated the MTX resistant mechanism of human osteosarcoma cell line at a gene level. The decreased expression of RFC mRNA and the increased expression of DHFR mRNA and GST-π mRNA participate in the MTX resistance in human osteosarcoma cell lines U-2 OS. This provides the evidence for exploring the MTX resistance mechanism in clinical osteosarcoma patients ,and helps to screen the patients who are insensitive to MTX chemotherapy.
Key words：real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR); methotrexate(MTX); reduced folate carrier（RFC）; dihydrofolate reductase(DHFR)； Glutathione-S-Transferases-π（GST-π）
随着新辅助化疗在骨肉瘤治疗中的应用及发展，骨肉瘤的5年生存率已由以前的10%～20%提高到现在的60%～70%。氨甲喋呤（MTX）作为新辅助化疗的主要药物，其在临床实践中存在原发或继发耐药而影响疗效的现象。以往研究表明，多种基因及表达产物可能参与其耐药机制。作者运用实时荧光定量PCR法，检测还原叶酸载体（RFC），二氢叶酸还原酶（DHFR），谷胱甘肽-S-转移酶-π（GST-π）在人骨肉瘤细胞株U2-OS及耐药细胞株U2-OS/R1-R3中基因水平的表达，为临床预测骨肉瘤的耐药程度，筛选化疗不敏感患者提供参考和依据。
1 材料与方法
1.1 材料 人骨肉瘤细胞株U2-OS（购自中国科学院上海生物细胞研究所），氨甲喋呤（MTX）（浙江海正药业公司）、MTT、DMSO（sigma产品），酶标仪(sigma960型)、荧光定量PCR试剂盒（Takara 公司）、RFC、GST-π、DHFR、GAPDH引物及Taqman探针（上海生工生物工程公司）。
1.2 方法与步骤
1.2.1 人骨肉瘤U2-OS细胞株培养于含10%胎牛血清、100 U∕ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RMPI 1640培养基中。细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。待细胞增殖至60%～70%融合状态时进行传代。加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃消化4～5 min，显微镜下见细胞收缩、细胞间隙变大，形态变圆后加入完全培养液终止消化，用吸管反复吹打培养瓶底贴壁细胞成细胞悬液，按1∶2比例接种于培养瓶中。
1.2.2 采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的诱导方法。待细胞增殖至铺满培养瓶底60%～70%对数期时，加入起始浓度为50 ng∕ml的MTX,作用24 h后用37℃的1×PBS缓冲液冲洗2次，加入不含药物的RPMI 1640培养液，每天换液1次，以清除死亡细胞及细胞碎片，到细胞增殖至正常状态后，重复上述药物冲击过程，每一种药物浓度冲击3次。MTX药物递增浓度为30 ng∕ml、300 ng∕ml、1 μg∕ml、3 μg∕ml。耐药诱导历时7个月，选用300 ng/ml(0.66 μmol/L)，1 μg∕ml(2.20 μmol/L)，3 μg∕ml(6.60 μmol/L)组细胞株(分别命名为U2-OS∕R1，U2-OS∕R2,U2-OS∕R3)与原代细胞株作对比试验。
1.2.3 生物学特性观察，倒置显微镜下观察U2-OS，U2-OS∕R1,U2-OS∕R2,U2-OS∕R3细胞株的细胞形态。
1.2.4 生长曲线测定，取对数生长期的U2-OS，U2-OS∕R1,U2-OS∕R2,U2-OS∕R3细胞株接种于24孔板，每孔细胞数为1×104个。每个细胞株间隔24 h取3个复孔用苔盼兰染色，计数其中活细胞的数量，连续计数7 d。按每天细胞计数数量绘制细胞生长曲线。
1.2.5 FQ-PCR法检测mRNA表达：RNA fast 200总RNA极速抽提试剂盒一步法提取各细胞株总RNA。逆转录试剂采用TaKaRa公司试剂盒（code:DDR037S），检测模板质量。荧光定量PCR试剂采用TaKaRa公司试剂盒（code:DDR039S）。RFC，DHFR，GST-π，GAPDH引物和探针均由上海生工生物工程公司合成，其基因序列见表1。Real-Time PCR反应体系20 μl,含Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，RFC，DHFR，GST-π，GAPDH上、下游引物各0.7 μl(浓度为6 μmol/L),Taqman探针各0.8 μl(浓度为4 μmol/L),ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl,模板（cDNA溶液）2 μl(相当于总RNA 100 ng),RNase free去离子水5.4 μl。反应仪器为ABI PRISM 7 500实时检测扩增仪。反应条件：预变性，95℃ 10 s 1个循环；PCR反应，95℃ 5 s 60℃ 45 s 40个循环。以SDS软件分析循环次数（Ct值），mRNA表达以⊿Ct值表示。⊿Ct=RFC或DHFR 或GST-π孔Ct值-GAPDH孔Ct值。每份标本各种基因的表达量均用其对应的GAPDH基因的量进行校正。目的基因的拷贝数计算公式:目的基因拷贝数2-⊿⊿Ct 法=（Ct目的基因－ Ct内参基因）试验组－（Ct目的基因－ Ct内参基因）对照组表1 RFC、DHFR、GST-π、GAPDH上下游引物及Taqman探针基因序列RFC上游引物5’-CGCCACCTTTCAGATTGCAT-3’20bp下游引物5’-CACGTCCGAGACAATGAAAGTG-3’22bp探针序列5’-(FAM)TCAACACGTTCTTTGCCACCATC(TAMRA)-3’23bpDHFR上游引物5’-TGGTTCGCTAAACTGCATCGT-3’21bp下游引物5’-CAGGAATGGAGAACCAGGTCTTC-3’23bp探针序列5’-(FAM)CCAGAACATGGGCATCGGCAAGAA(TAMRA)-3’24bpGST-π上游引物5’-CGGGCAAGGATGACTATGTGA-3’21bp下游引物5’-GGGCTAGGACCTCATGGATCA-3’21bp探针序列5’-(FAM)TGTCCCAGAACCAGGGAGGCAAGAC(TAMRA)-3’25bpGAPDH上游引物5’-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3’22bp下游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’21bp探针序列5’-(FAM)TCATCAGCAATGCCTCCTGCACCA-(TAMRA)-3’24bp1.2.6 统计学分析：各数据均以x-±s表示，组间比较采用t检验的方法，以α=0.05为检验水准应用SPSS 11.0软件，对所得数据进行处理。
2 结果
2.1 光镜下U2-OS及U2-OS/R1-R3细胞形态(图1～4)
倒置显微镜下观察：U-2OS、U-2OS/R1 U-2OS/R2、U-2OS/R3细胞均为贴壁生长，U-2OS细胞呈梭形，排列规则，体积中等，大小均匀，细胞核较大，胞浆较少（见图1）。U-2OS/R1、U-2OS/R2、U-2OS/R3细胞形状不规则，多为多角形，大小不均匀。胞浆明显增大（见图2～4），出现多核仁现象（见图2）。
2.2 生长曲线
系列1为原代U2-OS细胞，系列2、3、4分别为U2-OS∕R1,U2-OS∕R2,U2-OS∕R3细胞。
以细胞培养时间为横轴，每次细胞计数的平均数为纵轴，绘制生长曲线。各细胞株细胞在相同的条件下培养7 d，在细胞培养的第4 d开始产生明显差异。各耐药细胞株细胞增殖速度较原代细胞减慢，生长斜率减小。表明各耐药细胞株细胞较原代细胞的倍增时间延长。但各耐药细胞株细胞增殖能力表现相似。说明氨甲喋呤对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。
2.3 采用2-⊿⊿Ct 法比较各模板中目的基因（RFC mRNA， DHFR mRNA，GST-πmRNA）的相对含量。人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中RFC mRNA的表达为原代U2-OS的0.7 139、0.6 258、0.4 908倍（组间差别有统计学意义，P＜0.05）；U2-OS/R1-R3DHFR mRNA的表达为原代U2-OS的5.3 145、12.8 937、30.6 501倍（组间差别有统计学意义，P＜0.05）；U2-OS/R1-R3中GST-πmRNA的表达为原代U2-OS的1.9 081、3.5 420、4、8 319倍（组间差别有统计学意义，P<0.05）.图6为荧光定量PCR扩增曲线。 图1光镜下U-2OS细胞（×200） 图2光镜下U-2OS/R1细胞（×200） 图3光镜下U-2OS/R2细胞（×200） 图4光镜下U-2OS/R3细胞（×200） 图5U2-OS及U2-OS/R1-R3生长曲线 图6各细胞株RFC DHFR GST-πmRNA的表达荧光定量PCR扩增曲线3 讨论
对骨肉瘤患者预后影响因素的探讨一直是临床医师关注的问题。郭全义，卢世璧，张莉等［1］统计分析骨肉瘤患者84例，认为接受化疗是影响患者预后的主要因素。MTX作为最早公认的对骨肉瘤化疗有效的药物，其化疗耐药是造成临床骨肉瘤患者预后不良的主要因素。关于骨肉瘤的MTX耐药的机制仍然没有完全阐明。本试验通过构建人骨肉瘤耐药细胞株，模拟临床骨肉瘤患者MTX化疗耐药过程，对骨肉瘤耐药机制进行探索，筛选MTX化疗耐药指标，为进一步的基因转染治疗提供体外试验模型。
还原叶酸载体（RFC）又称RFC-1、FOLT、RFT-1或SLC19A1等［2］，人类RFC是一个包含591个氨基酸的完整膜蛋白，分子量为6.4 487万μ，有12个典型跨膜区的运输蛋白。Moscow等［3］分析报道RFC基因突变导致的RFC氨基酸序列和数量的改变使RFC的各个跨膜区发生相应的改变，从而影响载体的活性和功能。RFC介导的MTX跨膜运输是MTX进入肿瘤细胞的主要途径，即MTX的表达主要取决于RFC表达和功能活性。Massimo Serra等［4］研究发现在人骨肉瘤MTX耐药细胞株中RFC基因表达较原代细胞株RFC基因表达降低。本试验结果示耐药细胞株中RFC基因表达随耐药性增加而逐渐减少，结果与上相似。
二氢叶酸还原酶（DHFR）是单体酶，在辅酶NADPH的参与下形成F-DHFR-NADPH三元复合物，并将叶酸转换为体内DNA、RNA 以及蛋白质生物合成所必需的原料，因而该酶对于生物体的新陈代谢具有极为重要的作用 。当MTX 取代叶酸后，它与酶形成MTX-DHFR—NADPH三元复合物，就可以抑制核酸和蛋白质的合成 ，且MTX是二氢叶酸还原酶的天然底物，它与DHFR酶的亲和力比叶酸高105倍左右，因此MTX的抗肿瘤作用强而持久。本研究结果显示在人骨肉瘤MTX耐药细胞株中DHFR基因表达较原代细胞株DHFR基因表达升高，且随细胞耐药性的增加，DHFR基因的表达亦增加。本试验结果与Scionti I［5］结果一致。
谷胱甘肽S转移酶（GST）是一组具有多种生理功能的二聚体蛋白质。谷胱甘肽S转移酶（GST）主要分布于人和动物的肝细胞浆中，分为α、μ和π。其中GST-π被认为是多种肿瘤的标志物［6］。GST-π是通过水解GSH与疏水性或亲电性复合物之间的连接而起细胞内的解毒作用，成为肿瘤耐药的因素之一。目前有观点［7］认为化疗药物不能诱导GST-π的表达，GST-π的过表达可能是恶性细胞的表型特性，提示化疗与GST-π的表达可能不存在相关性，本研究结果不支持以上观点。国内魏玲、宋现让等［8］收集临床标本34例，研究发现骨肉瘤患者化疗可引起GST-π上调。与本试验结果部分相同。
本试验采用实时荧光定量PCR技术，它具有探针杂交的高度特异性并结合PCR技术的高效核酸扩增、光化学技术的敏感及易定量等优点，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了灵敏度，其结果用拷贝数来表示，这种绝对数量更为准确，易于统一标准，便于不同试验室之间进行比较 ［9］。本试验采用实时荧光定量PCR法，定量检测了RFC、GST-π、DHFR mRNA在人骨肉瘤细胞系及耐MTX细胞系中的表达，表明RFC、GST-π、DHFR参与了人骨肉瘤细胞MTX耐药机制的形成，为临床药物的研发提供了新的靶点。
临床骨肉瘤患者MTX化疗的耐药可能受到年龄、性别、生活习惯、病理类型等诸多临床因素的影响，本试验通过体外建立骨肉瘤细胞耐MTX模型，提示临床骨肉瘤耐MTX患者可能存在RFC、DHFR、GST-π基因表达的变化，研究RFC、DHFR、GST-π基因表达的变化，对于推断临床骨肉瘤患者MTX化疗可能的耐药机制有重要的指导作用。在临床工作中对骨肉瘤患者进行检测RFC、DHFR、GST-π在基因或蛋白水平的表达，有助于筛选MTX化疗不敏感患者并对下一步的基因治疗提供重要依据。但由于骨肉瘤细胞体外培养并不能完全模拟骨肉瘤在人体内的生长，故本实验结论尚待进一步临床验证。
【参考文献】
［1］ 郭全义，卢世璧，张莉等.骨肉瘤的治疗及生存率的多因素分析［J］.中国矫形外科杂志，2006，7：497-499.
［2］ 邓高荣,李书忠.还原性叶酸载体与骨肉瘤甲氨蝶呤化疗［J］.国外医学:骨科学分册, 2005,3:150-152.
［3］ Moscow JA.Methotrexate transport and resistance［J］.Leuk Lymphoma，1998，3:215-224.
［4］ Serra M.Analysis of dihydrofolate reductase and reduced folate carrier genestatus in relation to methotrexate resistance in osteosarcoma cells ［J］.Annals of Oncology,2004,15:151-160.
［5］ Scionti I, Michelacci F.Clinical impact of the methotrexate resistance-associated genes C-MYC and dihydrofolate reductase (DHFR) in high-grade osteosarcoma［J］.Ann Oncol，2008，8:1500-1508.
［6］ Yoshiro N.Serum glutathione-s-transferase π as a tumor marker for gastrointestinal maligancies ［J］. Cancer,1989,63:317.
［7］ Sauerbreg A，Volm M，Zintl E,et al.Expression and clinical significance of resistance proteins in initial acute lymphatic leukemia（All） in childhood［J］.Klin Padiatr,1995,207:230.
［8］ 魏玲，宋现让，等.MDRI和GST-π在骨软组织肉瘤中的表达及其与化疗耐药的关系［J］.中华肿瘤杂志，2006，6：445-448.
［9］ Ginzinger DG.Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream［J］.Exp Hematol,2002,30:503-512.
作者单位：青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东青岛 266003