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【摘要】 目的 探讨卵巢癌组织中耐药相关蛋白P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ的表达与ATP-肿瘤体外药敏试验（ATP-TCA）结果的关系。方法 采用ATP-TCA法对24例原发上皮性卵巢癌患者手术切除的新鲜癌组织进行体外药物敏感性测定，分别检测对泰素、顺铂、健择、阿霉素、拓扑替康5种化疗药物的敏感性。同时用免疫组化检测组织中P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ的表达。结果 24例上皮性卵巢癌手术标本中，ATP-TCA可评价率95.83%，所测标本对药物的体外敏感率依次为泰素91.30%，健择86.96%、阿霉素65.22%、拓扑替康47.83%、顺铂21.74%，GST-π蛋白阳性表达与卵巢癌组织体外对顺铂的耐药相关（P=0.037），P-gp、opo-Ⅱ蛋白阳性表达与卵巢癌组织体外泰素、健择、阿霉素、拓扑替康、顺铂的耐药均不相关，P>0.05。结论 卵巢癌组织GST-π蛋白表达与体外对顺铂的耐药相关，GST-π阳性表达是否可以作为预测上皮性卵巢癌患者耐药的标志物，值得进一步扩大样本进行临床研究。
关键词 P-gp GST-π Topo-Ⅱ ATP-TCA 免疫组化SP法 上皮性卵巢癌（PEOC）
The expression of P-gp，GST-πand Topo-Ⅱproteins in primary epithelial ovarian cancer
and their relationship with ATP-tumor chemosensitivity assay.
Gao Guolan，Qi Qingping，Zou Xuesen，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology，Jiangxi Cancer Hospital，Nanchang330029.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the three drug resistance-associated proteins P-gp，GST-π，Topo-Ⅱand ATP-TCA.Methods ATP-TCA was used to detect the sensitive rate of24specimens of fresh ovarian cancer tofive cytotoxic drugs as follows:paclitaxel（TAX），gemcitabine（GEM），doxorubicin（ADM），topoteˉcan（TPT）and cisplatin（DDP）.Meanwhile，expressions of P-gp，GST-πand Topo-Ⅱproteins were examined in paraffin-bedded sections from these24resected specimens by S-P immunohistochemical staining.ResultsEvaluable testresults were achieved in23of24specimens，the evaluability rate of ATP-TCA was95.83%.The ex vivo sensitive rate of TAX was91.30%，of GEM was86.96%，of ADM was65.22%，of TPT was47.83%，of DDP was21.74%seˉquently.The expression of GST-πprotein was concordant with the resistance to cisplatin（P=0.037），but not with that to TAX，GEM，ADM and TPT.The expression of Q-gp and Topo-Ⅱproteins was not associated with any resistance to DDP，ADM，TAX，GEM and TPT.Conclusion The positive expression of GST-πprotein might be correlated with the resistance to cisplatin in PEOC.Further clinical studies in a large group of patients were needed forconfirmation whether GST-πprotein expression could become a useful marker to predict the resistance in epithelial ovarian cancer patients.Key words P-glycoprotein glutathione S-transferase-pi topoisomeraseⅡ ATP-tumor chemosensitivity assay S-P immunohistochemical
化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。常规化疗仅凭经验用药，存在着盲目性，且化疗过程中易出现多药耐药（multidrug resistance，MDR），因此疗效不理想。一直以来，肿瘤学家们致力于通过体外药敏试验筛选敏感药物指导个体化治疗 ［1］ ，同时从分子 水平探讨可能导致肿瘤耐药的原因，取得了一定的进展。但有关耐药蛋白表达与体外药敏关系的研究却鲜有报道。笔者采用ATP肿瘤体外药敏试验（ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA），对24例原发上皮性卵巢癌患者手术切除的新鲜癌组织进行体外药物敏感性测定，同时检测P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ蛋白的表达，分析耐药蛋白表达与ATP肿瘤体外药敏结果的关系，旨在为临床预测耐药，指导个体化化疗药物选择提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2002年8月～2003年12月在江西省肿瘤医院妇产科住院手术的卵巢癌患者24例（病理学证实为上皮性卵巢癌，术前未行化疗），年 龄22～76岁，平均51.6岁，肿瘤标本离体后立即取材，选择肿块边缘血供较丰富、细胞活性较好的部分装入含有100U/ml的青霉素、100μg/ml链霉素的MI1640的离心管中，即刻送我院肿瘤研究所进行ATP-肿瘤体外药敏试验，另取一部分标本10%甲醛固定，常规石蜡包埋备用。表1 24例上皮性卵巢癌临床病理资料 (略）
1.2 抗肿瘤化疗药物 泰素（TAX）（美国百时美施贵宝公司）、顺铂（DDP）（冻干型）（山东德州）、健择（GEM）（法国Lilly公司）、阿霉素（ADM）（浙江海正）、拓扑替康（TPT）（江苏恒瑞）。用生理盐水配制化疗药物储存液:TAX6mg/ml、cDDP2mg/ml、GEM40mg/ml、ADM2mg/ml、TPT1mg/ml。TAX、cDDP、ADM40C保存。GEM-200C存放，TPT-700C存放。文献 ［2～4］ 提供的血浆峰浓度（peakplasma concentraˉtion，PPC）:TAX13.6μg/ml、DDP3.8μg/ml、GEM25μg/ml、ADM0.5μg/ml、TPT0.75μg/ml。
1.3 主要试剂仪器 ATP-TCA核心试剂盒（德国DCS产品，购自深圳达科为生物技术公司）:包括完全分析培养基（CAM）、最大ATP抑制剂、组织消化酶液、ATP提取液、荧光素-荧光素酶（lulu）、Tris-Buffer、ATP标准品。MPL-自发光分析仪（德国erthold）、TC-2323CO 2培养箱（美国Shelton）。
1.4 免疫组化染色 采用微波炉煮沸脱交联SP法，操作按试剂盒说明进行。每批实验均用已知P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5 免疫组化结果判定标准 按文献报道 ［5，6］ ，P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ分别以细胞膜、细胞浆、细胞核内是否出现棕黄染色颗粒判定阳性或阴性。P-gp定位于细胞浆和细胞膜，以细胞膜为主，GST-π定位于细胞浆，Topo-Ⅱ定位于细胞核。阳性判断标准:每张切片分别由两位病理专家阅片，观察10个高倍视野，共计数1000个细胞，按阳性肿瘤细胞 占百分比计算，“-”为不染色，“±”为≤10%，“+”为>10%。将“-”和“±”作为阴性表达，余定为阳性。
1.6 ATP-TCA操作步骤 （1）无菌条件下将肿瘤组织约1cm×1cm×1cm，充分剪切成小碎块，加入消化酶液，37℃孵育4～6h，期间每30min混匀1次。消化毕，细胞解离液过300目钢网，1500rpm，离心5min，用RPMI1640重悬备用;（2）2%台盼蓝染色观察细胞活性，并计数细胞数，用CAM稀释至1.5～2.5×10 5 个/ml;（3）将8000%PPC的各化疗药物于96孔细胞培养板内依次倍比稀释至6个梯度药物浓度（400%～12.5%PPC，A-F行），每个浓度3复孔，每孔0.1ml。（4）各孔加入0.1ml肿瘤细胞悬液，无药对照孔（MO）（G行）加入0.1ml肿瘤细胞悬液和0.1mlCAM，ATP最大抑制对照孔（MI）（H行）加入0.1ml肿瘤细胞悬液及0.1mlATP最大抑制剂，（5）于37℃，5%CO 2 ，95%湿度下培养6天后加入肿瘤细胞ATP提取液50μl，混匀后室温下放置30min。（6）用自发光分析仪检测，DCS软件系统自动进行数据分析。计算各浓度下肿瘤细胞生长抑制（TGI），TGI=［1-（有药孔-MI）/（MO-MI）］×100，敏感度指数（Indexsum=600-各个浓度的TGI之和）。
1.7 ATP标准品的检测 ATP标准品生理盐水配成系列浓度:10 -5 、10 -6 、10 -7 、10 -8 、10 -9 、10 -10 mol/L，取50μl各浓度ATP标准品加入荧光-荧光素酶50μl，快速混匀，每浓度3复孔。用自发光分析仪检测。以浓度对光脉冲数绘制标准曲线。
1.8 ATP-TCA结果的评估 （1）所测标本须经细胞学和病理学证实为恶性肿瘤，细胞悬液中活细胞数>80%，肿瘤细胞数>20%，（2）培养过程中MO孔必须可观察，结束后检测值MO孔必须大于所有有药孔，ATP含量>10～8mol/L。（3）3复孔间CV值<20%。（4）ATP-TCA化疗药物敏感耐药判断以Indexsum<300为敏感，≥300为耐药 ［4］ 。
1.9 统计学方法 SPSS11.5软件处理数据，ATP标准品数据进行直线相关分析，并进行相关系数检验及配对t检验。P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ蛋白表达率和体外药物敏感性的关系采用Fisher’确切概率法分析。
2 结果
2.1 ATP标准品曲线 以ATP浓度（mol/L）的对数为横坐标，荧光值对数为纵坐标，绘制曲线，直线回归方程:Y=0.939X+10.842相关系数r=0.995，P<0.001。平均变异系数CV=1.2%（0.7%～8.5%），见图1。图1 ATP标准品曲线
2.2 5种化疗药物体外药物敏感性试验结果比较 在收集的24例手术标本中，23例可评估，可评估率为95.83%（23/24），其中1例失败，为细菌污染，试验结果显示卵巢癌个体对不同化疗药物具有不同的敏感性，显示出肿瘤的异质性（图2，3，4）。在所测的药物中最敏感的为TAX，敏感率91.30%（21/23），其次为GEM86.96%（20/23），ADM敏感率为65.22%（15/23），TPT47.83%（11/23），DDP21.74%（5/23）。结果见表2。表2 5种化疗药物敏感性试验结果 图2 化疗药物敏感性比较图3 药物剂量-效应曲线图4 药物剂量-效应曲线
2.3 5种化疗药物敏感性与P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ蛋白表达的关系 23例PEOC标本中，P-gp蛋白阳性表达9例（39.39%），ST-π阳性表达11例（47.83%），Topo-Ⅱ蛋白阳性表达18例（78.26%）。体外药敏结果显示，TAX、GEM、ADM、TPT的耐药性与各种耐药蛋白表达之间无明显相关。体外对DDP的耐药与GST-π蛋白阳性表达之间相关，P=0.037，但与P-gp、Topo-Ⅱ蛋白表达无关，见表3。 表3 P-gp、Topo-Ⅱ、GST-π表达与ATP体外药敏结果的关系（略）
3 讨论
3.1 ATP-TCA的可行性及临床价值 本实验中ATP标准品浓度（10 -10 ～10 -5 mol/L）与荧光计数值之间为一线性关系，显示通过测定ATP浓度可以反映细胞的活性状态。24例卵巢癌手术标本中，23例可评价，可评价率95.83%，与文献 ［1］ 报道相近。其中1例由于细菌污染而培养失败。ATP-TCA采用荧光检测方法，灵敏度高，检测范围可达10 5 级数，且可定量。检测所需肿瘤细胞数极少，最低50～250个细胞;能检测肿瘤细胞的总体杀伤情况，对细胞增殖无依赖关系，理论上对各种不同作用机制的药物都能测定，克服了克隆形成法、放射性标记核酸前体掺入法只能检测增殖期细胞的弱点。干扰ATP-TCA的因素少，而MTT法中细胞代谢率、pH值、温度和药物都可能影响MTT的转化。无血清培养基中肿瘤细胞选择性生长，克服了含胎牛血清的培养基既促进正常细胞的生长，又影响药物活性的不足，使肿瘤细胞平均含量从培养前的54%上升至培养后的83%，每孔细胞数仅需1.0×10 4 ～2.0×10 4 个 ［6］ 。在6个药物浓度梯度下同时检测肿瘤细胞药物的敏感性，得出药物的剂-效曲线，符合药物的体内药代动力学;O ， meara ［7］ 等总结克隆形成法、MTT法、荧光细胞印迹法、差别染色法可评价率分别为57.6%、70%、80.0%、77.0%，阳性预测值分别为60.0%、83.3%、85.0%、76.0%。日本广岛大学比较克隆形成法、MTT法、ATP-TCA、琥珀酸脱氢酶抑制法、放射性标记前体法可评价率 分别为57.9%、66.7%、92.0%、90.1%、80.2%，预测准确率为52.9%、50.0%、80.3%、58.8%、70.8%。尽管体外药物培养结果并不能完全代表体内的结果，但在目前无理想的体内药敏检测方法的情况下，ATP-TCA在临床选药上起到重要的指导作用，值得临床进一步研究。
3.2 卵巢癌化疗药物敏感性比较的意义 本研究显示23例卵巢癌组织对化疗药物的体外敏感率依次为TAX91.30%（21/23），GEM86.96%（20/23），ADM65.22%（15/23），TPT47.83%（11/23），DDP21.74%（5/23），表明不同的卵巢癌患者对化疗药物的敏感性不同，充分印证了肿瘤的异质性。肿瘤患者间个体差异明显。我们的实验中TAX、GEM体外敏感率分别为91.30%、6.96%，与DDP相比，敏感率差异有显著性，而且在耐药蛋白表达阴性、阳性时无统计学差异，也提示无论对原发患者、还是复发后产生获得性耐药患者，采用TAX、GEM都可能带来积极的效果。值得注意的是，ADM敏感率为65.22%，与DDP相比差异也有显著性。ADM为细胞周期非特异性药物，临床上ADM确有很高的治疗指数，唯其心脏毒性作用较强而使其应用受限。Hogberg ［8］ 等总结比较1187例上皮性卵巢癌患者分别进行PC（DDP+环磷酰胺）方案和PAC（DDP+ADM+环磷酰胺）方案化疗的研究资料，得出PAC方案优于PC方案，术后小或无残余灶患者接受PAC治疗比PC治疗生存期更长，死亡的危险性下降16%。本研究也提示大部分原发上皮性卵巢癌对ADM敏感，在临床可耐受情况下，使用ADM将会改善预后。TPT敏感率为47.83%，特别是在DDP耐药的病例往往TPT敏感，表明TPT与DDP无交叉耐药，与国内研究 ［9］ 结果类似。DDP的敏感率为21.74%，刘珊玲 ［9］ 等研究DDP敏感率为58.2%，但国外研究表明对原发卵巢癌患者临床单药DDP化疗有效率只有33% ［10］ ，早期ATP-TCA研究表明原发卵巢癌组织对DDP的体外敏感率只有15.4%，联合4-HC则敏感率提高到53.8% ［11］ 。究其原因可能是本研究采用的ATP-TCA在6个药物浓度范围检测肿瘤细胞对药物的敏感性，根据剂量-抑制曲线来进行判断，相比较而言，比以单点浓度下抑制率的判断标准敏感率低 ［9］ ，但更符合药物的体内药代动力学，更准确的反映体内情况，与临床及预后的相关性更好。
3.3 化疗药物体外药敏试验与耐药蛋白表达之间的相关性 研究认为，P-gp介导耐药的相关药物为天然抗癌药物如蒽环类、生物碱类、鬼臼毒素类和泰素等;GST-π结合的底物则是具有亲电子性的铂类制剂和烷化剂;Topo-Ⅱ介导at-MDR的抗癌药物包括鬼臼类药物、VP16及阿霉素等。
Bergman ［12］ 等研究转染了mdr1基因而获得MDR表型的一些人肺癌、卵巢癌、黑色素瘤细胞系时发现，这些耐药细胞系反而对GEM的敏感性提高了9～72倍，认为细胞系对GEM的敏感性增加是与脱氧胞苷激酶的活性增加有关，因为接触MDR药物后，那些存活下来的表达P-gp和MRP的肿瘤细胞系含有更多活性酶谱。体外细胞系研究也表明TPT耐药与细胞内药物浓度改变有关，使用相关的P-gp逆转剂可以逆转对TPT的耐药，由此推断其逆转耐药是通过恢复细胞内药物浓度，而不是作用于Topo-发挥作用的 ［13］ 。
本试验结果显示在P-gp蛋白表达阴性的卵巢癌标本中，药敏结果显示对检测药物除DDP外敏感性均较高，尽管统计学差异无显著性。未观察到卵巢癌组织P-gp蛋白表达阳性而对GEM的敏感性有所增强。所有体外对药物敏感的肿瘤组织中，GST-π蛋白为阴性表达，但只有DDP的耐药与GST-π蛋白表达增高相关（P=0.037）。Topo-Ⅱ蛋白阳性表达率高，对ADM、GEM、TAX、TPT敏感的例数多，相反，Topo-Ⅱ蛋白表达率越高对DDP越不敏感，这也证明了Topo-Ⅱ蛋白的双重作用。Stier ［14］ 等在79例卵巢癌中进行ATP-TCA，并检测Topo-Ⅱα的表达，发现Topo-Ⅱα蛋白阳性表达的细胞比 阴性细胞对ADM、TAX、DDP更敏感。黄瑾［15］ 报道DDP的耐药与GST-π表达增高相关，联合ATP-TCA和GST-π预测卵巢癌的化疗敏感或耐药的准确性达100.0%或90.9%。笔者认为尽管GST-π蛋白表达仅与卵巢上皮癌体外对DDP的耐药相关，但目前卵巢癌还是以铂类为主的化疗，在进行药敏的同时检测GST-π蛋白有一定的指导价值，可以避免无效化疗。如GST-π表达阳性同时体外对DDP不敏感，提示患者用铂类药物治疗无效，必须寻求其他有效药物。本研究初步探讨两者的相关性，GST-π是否可以作为预测上皮性卵巢癌患者耐药的标志物，值得进一步扩大样本进行临床研究。其他两种耐药蛋白表达与体外药敏的关系无统计学差异，一方面表明可能亦存在其他的耐药机制，另一方面可能尚需进一步扩大样本研究。同时我们发现在对一种化疗药物耐药的细胞中，往往同时表达多种耐药蛋白。随着研究的深入，人们已经了解到，对一种药物表现出耐药，往往有多种耐药机制参与，单一的耐药机制不适于解释某些耐药现象，就如TAX，最早发现P-gp过度表达与其有关，还有微管分子、凋亡路径及有丝分裂检查点蛋白的改变，最近表明脂质合成的改变及白介素-6过度表达也参与其耐药性 ［15］ 。
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作者单位:1330029南昌江西省肿瘤医院妇产科
2330000江西省肿瘤研究所
（收稿日期:2004-07-13）
（编辑李 欣）