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灵敏的人血清甲状腺球蛋白单克隆抗体ELISA法的建立
标记免疫分析与临床 2000年第2期第7卷 方法研究
作者：汤特 叶静 张天庚 陈祖培 阎玉芹
单位：天津医科大学内分泌研究所 天津300070
关键词：甲状腺球蛋白；单克隆抗体；酶联免疫吸附测定
摘要 为提高对人血清甲状腺球蛋白检测的灵敏度， 本文采用杂交瘤细胞技术制备了鼠抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体(McAb)，建立了灵敏的Tg ELISA双抗体夹心法。其灵敏度为1ng/mL；批内变异系数为5.3%(40例)，批间变异系数为6.7%(10例)，116名健康献血者血清中含有甲状腺球蛋白的占72.4%。
Sensitive Measurement of Human Serum Thyroglobulin
Using Monoclonal Antibody ELISA Method
Tang Te, Ye Jing, Zhang Tiangeng
（Institute of Endoerinology, Tianjin Medical Univerisity, Tianjin 300070）
Abstract A rapid, sensitiive and specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)method, using mouse monoclonal human thyroglobulin antibodies, was established in our laboratory for measuring human serum thyroglobulin with a sensitivity of 1ng/mL. Thyroglobulin was detectable in 72.4% of 116 normal subjects.
Key words Thyroglobulin Monoclonal antibodies Enzyme-linked immunosorbent assay
甲状腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)是甲状腺滤泡上皮细胞合成的一种糖蛋白， 分子量为660KD, 沉降系数为19s。在正常生理情况下， 有一部分Tg进入血液循环； 在病理情况下， 可因甲状腺滤泡上皮细胞的破坏或通透性增加， 而引起血中Tg水平的增高。 血中Tg含量甚微， 目前多采用放射免疫技术进行检测， 但因该法受到一些条件限制， 不能广泛应用。 本文建立了TgMcAb ELISA双抗体夹心法， 该法克服了原先放免法的缺点， 而在特异性、灵敏度上与之相一致， 更易于推广应用。
材料与方法
1 材料
1.1 甲状腺 取甲亢患者手术切除后的新鲜甲状腺组织。
1.2 家兔 大耳白纯种家兔(♂，2.5kg)。
1.3 小鼠 6～8周龄雄性BALB/C小鼠， 由北京实验动物中心提供。
1.4 细胞 108脾细胞， SP2/0小鼠骨髓瘤细胞， 4×105杂交瘤细胞。
1.5 其它原材料 Sephadex G-200, DEAE-52,福氏完全(或不完全)佐剂， 聚乙二醇， 二甲基亚砜，辣根过氧化物酶， 降植烷及辛酸， 硫酸铵等， 均为进口和市售的国产试剂。
1.6 仪器 酶联免疫检测仪DG 3022型(南京华东电子管厂)，高速离心机J2-21BECKMAN, 二氧化碳培养箱GCA(美国)， 倒置显微镜88170(重庆)等。
2 方法
2.1 人Tg的提取与纯化 取新鲜甲状腺组织制成匀浆， 过滤、离心，上清液通过Sephadex G-200及DEAE-52柱层析， 即获纯化Tg［1］。冷干，-80℃保存备用。 100克甲状腺组织可得纯品甲状腺球蛋白1.5克。
2.2 兔抗人Tg多克隆抗体制备与纯化 取上述纯化的Tg免疫大耳白家兔， 皮内多点注射。 产生抗体后， 取血分离血清， 经硫酸铵、DEAE-52柱层析纯化， 可得高效价兔抗人Tg抗体。
2.3 鼠抗人Tg单克隆抗体制备与纯化
2.3.1 Tg免疫小鼠 用纯品的Tg免疫小鼠， 将抗原与福氏完全佐剂等量混合， 抗原为100μg/只。 每二周注射1次共2次， 第3次免疫用加入不完全佐剂的Tg乳液，在融合前3天， 自尾静脉注入不加佐剂的0.1mLTg加强免疫。
2.3.2 细胞融合及克隆化 取108脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞， 以50%聚乙二醇加0.5%二甲基亚砜为融合剂进行融合［2］。
2.3.3 抗TgMcAb制备及纯化 将0.5mL降植烷注入BALB/C小鼠腹腔内， 2～3周后再注入4×105杂交瘤细胞， 10天后收集腹水。 采用辛酸-硫酸铵二步法进行纯化［2］。
2.4 TgMcAb ELISA双抗体夹心法的建立
2.4.1 TgMcAb酶标记及纯化 采用过碘酸钠法进行标记［3］。将辣根过氧化物酶标记TgMcAb,用辛酸-硫酸铵二步法进行纯化， 结果表示， 酶与IgG克分子比为2.19:1，ELISA检测酶联物1：25万稀释， 测定OD值为2.39。纯化后的酶联物经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条带。
2.4.2 实验步骤 ①包被McAb， 用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释成10μg/mL， 每孔加入100μL,4℃ 18～20小时。 ②用1%BSA封闭。③加样， 将纯化的Tg稀释为每毫升含100ng、50ng、10ng、5ng、2.5ng、1.25ng作标准曲线， 加阴性对照、质控血清、待测血清。④加入辣根过氧化物酶标记的McAb。⑤加底物及30%H2O2， H2SO4终止反应， 酶标仪测OD， 波长490nm。
结果
1 抗Tg多克隆抗体鉴定
1.1 电泳鉴定 将纯化的Tg与兔抗人Tg血清作免疫电泳出现一条沉淀线，与抗人全血清不出现沉淀线。 聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现一条带。 沉降系数为18.6S。
1.2 效价测定 抗体效价为1：64(琼脂扩散)， 酶免法为1：10000。聚丙稀酰胺凝胶电泳显示一条带， 但条带较宽， 条带前沿仍有轻微染色， 表明Tg抗体非单一分子量物质， 但与Tg有特异性结合。
2 抗Tg单克隆抗体鉴定
2.1 滴度测定 本实验一次融合成功。 为寻求高亲和力抗体， 亚克隆后选择强阳性孔(OD值大于2.0)，再经3次克隆， 获得4株稳定分泌Tg特异性抗体的杂交瘤细胞株(TB2、TB6、TD6、TG3)。细胞株体外培养6个月， 液氮冻存12个月， 复苏后仍保持稳定分泌Tg抗体的功能， 上清液抗体滴度维持在1：1280。
2.2 电泳鉴定 纯化的腹水经聚丙烯酰凝胶电泳显示为一条带。 用ELISA法检测腹水及上清液抗体效价分别为1：104～1:106及1：640～2560。所测OD值大于2.0，表明纯化后的McAb保持良好的抗体活性。
3 单克隆抗体的免疫学鉴定
3.1 特异性鉴定 选择抗体效价高的TD6细胞株分泌的McAb， 用ELISA法分别与T3、T4、TM和TSI作用。 结果TgMcAb与Tg反应呈强阳性， 而且呈剂量反应关系， 说明发生特异性结合， 与其他无交叉反应。
3.2 亲和力测定 选择抗体效价较高的TD6、TB2二株细胞产生的腹水进行亲和力测定， 结果表示二者50%最大结合浓度分别0.1ng/mL和0.18ng/mL。由于亲和力越大， 所需抗体浓度越低， 因此相对亲和力为TD6大于TB2。
3.3 IgG类型 采用鼠单克隆抗体亚类的药盒(Gibco BRL公司产品)， 按试剂盒说明书操作，结果均为IgG类IgG1亚类。
3.4 抗体表位鉴定 用免疫双扩散实验测定McAb识别抗原表位异同， 结果4株细胞株抗TgMcAb识别同一抗原表位。染色体检查符合杂交瘤细胞株。
4 Tg ELISA方法学的鉴定
4.1 特异性 在含有Tg的血清中加入羊抗人Tg血清作中和试验， 5份含Tg血清的OD值分别为0.70、0.78、0.87、0.70及0.76，而加入羊抗人Tg后， 其光密度为0.01、0.02、0.01、0.00及0.015。
4.2 灵敏度 本法可测Tg的最小含量为1ng/mL。标准曲线在1～100ng/mL的范围内线性良好，r值为0.99。
4.3 回收试验 取3份血清作回收试验， 其回收率为90%、93.8%和98.0%，平均值为93.9%。
4.4 重复性 根据结果统计，该方法批内CV为5.3±0.1%(20例)，批间CV为6.7±0.2%(8例)。
5 正常值范围
116名健康献血者血清Tg含量呈偏态分布， 本文所测Tg平均值为8.7ng/mL， 标准差为3.44, 第95百分位(p95)为16.42ng/mL。在116人中， 在约65.27%的人在2.26～15ng/mL范围内， 所以正常值范围为小于1.3～20ng/mL。 大于20ng为升高。可测得116名健康人中有72.4%的血清含有Tg。
讨论
近年来随着检测技术的发展和研究的深入， 人血清中Tg越来越受重视。 Tg是一种正常的血清成分， 其浓度可在多种生理和病理的情况下发生改变。 检测血清Tg含量， 是早期诊断， 早期防治地方性甲状腺肿及给碘后疗效观察的一项有意义的客观指标。 此外， Tg的测定对于非髓样甲状腺癌的疗效判断、手术是否彻底以及有无转移等都是有用的指标。 也有助手假性甲状腺毒症， 无痛性亚急性甲状腺炎和新生儿甲状腺功能低下等疾病的诊断［3］。
国外70年代前后开始建立Tg放射免疫分析法(RIA)， 目前国内临床上对血清Tg的检测大多采用此法。80年代初， 随着抗Tg单克隆抗体的制备，Tg免疫放射分析法(IRMA)开始建立， 使Tg检测的特异性和灵敏度进一步提高［2］。所以高亲和力的抗Tg单克隆抗体是建立高灵敏度的Tg检测方法的必要条件。 为此本文应用杂交瘤技术制备了抗Tg单克隆抗体， 应用ELISA双抗体夹心法检测血清中Tg含量。
实验结果表明： 本法的Tg最小检测量为1ng/mL， 文献报告为1.6ng/mL［5］（PcAb RIA),1ng/mL［6］(PcAb RIA)， 3ng/mL［7］(PcAb ELISA)， 结果表明本法灵敏度较高。
本法批内CV5.3%，批间CV为6.7%， 国内报道的ELISA法为11.8～16.1%［3］，国外报告McAb ELISA法为3.9～7.1%［5］。
本法的McAb ELISA双抗体夹心法正常范围为1.3～20ng/mL，大多数文献报道RIA的正常值为1.6～20ng/mL［5］，2～27ng/mL［6］，ELISA的正常值为10～50ng/mL［3］。我国卫生部地办室公布的儿童和成人血清Tg中位数正常值为10ng/mL，在许多测试中， 把20ng/mL定为正常值上限。
从上述结果可见， 本文建立的McAb ELISA双抗体夹心法检测血清Tg具有特异性强、灵敏度高和回收率高等特点。 与RIA相比安全，又无污染。 与国外同类型方法相比，成本相对低， 操作简单， 便于推广应用。 对科研及临床上甲状腺疾病的诊断和疗效判断有一定的实用价值。
该研究课题为国家“九五”攻关子课题。
参考文献
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(1999-08-16收稿， 1999-11-15修回)