体外单核巨噬细胞诱生IFN-α的因素分析

体外单核巨噬细胞诱生IFN-α的因素分析

免疫学杂志 1999年第2期第15卷 基础免疫学

作者：孙路虹　姚　堃　季晓辉　丁如宁　李焕娣

单位：南京医科大学微生物学教研室 南京 210029

关键词：M-CSF；IFN-γ；IFN-α；NDV；单核细胞

　　摘　要　观察了M-CSF预处理、IFN-γ预处理、长程培养及新城疫病毒（new-castle disease virus，NDV）刺激4个因素对正常人外周血单核细胞体外产生IFN-α水平的影响，采用生物活性法检测IFN-α。结果表明：单独使用M-CSF不能诱生IFN-α；单独使用IFN-γ或单独使用NDV均只诱生较低水平IFN-α，只有M-CSF＋IFN-γ＋NDV或IFN-γ＋NDV联合使用方可诱生较高水平的IFN-α，并且发现M_ο、-M_φ长程培养也是向高产发展的一个重要因素。结论：人血M_ο、-M_φ在适当体外培养条件下，可以诱发较高水平的IFN-α。

　　中图号　R392

ANALYSIS OF FACTORS AFFECTED IFN-α INDUCTION BY HUMAN BLOOD MONOCYTES IN VITRO

Sun Luhong，Yao Kun，Ji Xiaohui，Ding Runing，Li Huandi

（Department of Microbiology，Nanjing Medical University，Nanjing 210029）

　　Abstract　M_ο-M_φ could hardly induce IFN-α in vitro，especially at high level．This paper reported 4 factors affected IFN-α induction from cultured M_ο-M_φ．The results showed treatment singly with M-CSF couldnt induce IFN-α．Treatment with IFN-γ alone or stimulation with NDV alone could induce low level of IFN-α．Treatment with M-CSF，IFN-γ and NDV proved to be the best．The age of M_ο-M_φ culture was also an important factor．

　　Key words　M-CSF，IFN-γ，IFN-α，NDV，Monocyte

　　IFN-α的体外诱生通常用NDV或仙台病毒作用于B细胞，使之产生IFN-α，用M_ο-M_φ（单核-巨噬细胞）诱生IFN-α是相当困难的。本文通过改变M_ο-M_φ的培养条件，使之适于诱生IFN-α，观察了4种因素：M-CSF的预处理，IFN-γ的预处理，M_ο-M_φ长程培养和NDV刺激对诱生IFN-α的影响。4种因素或单独使用或联合使用，出现许多不同的效应，现报道如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　细胞系和病毒：人羊膜WISH株按常规培养传代，用于滴定IFN-α；水泡性口炎病毒（VSV）本室低温保存，用于滴定IFN-α；NDV来自本室，用于诱生IFN-α。

　　1.1.2　试剂：rhM-CSF由南京大学生物系提供，比活性1．2×10⁶CFU／mg；rhIFN-γ由上海生物制品研究所提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　单核细胞的分离^［1］：从健康人新鲜静脉血中分离单个核细胞，以1×10⁷／ml细胞浓度加入96孔细胞培养板，每孔200μl；置37°C 5％CO₂贴壁培养2h；洗3次去非粘附细胞，贴壁的即为单核细胞，每孔约有贴壁细胞0.3×10⁵～1×10⁵个，经非特异性酯酶染色证实所得细胞95％以上为单核细胞。

　　1.2.2　IFN-α的诱生：根据参考文献［2］并予改进。诱生IFN-α共用4个可变因素，即NDV（血凝效价1∶1280）20μl／孔，M-CSF（5 000U／ml）100μl／孔，IFN-γ（1 000U／ml）100μl／孔和长程培养时间。培养条件均为37°C 5％CO₂。①将含有单核细胞的培养板分别培养1，3，7，12d后，加IFN-γ、M-CSF或NDV分别培养24h，收集上清；或加IFN-γ、M-CSF分别培养24h后再加NDV培养24h，收集上清，详见表1。②在含有单核细胞的培养板孔内加入M-CSF分别预处理1，3，7，12d后，加入IFN-γ、NDV分别培养24h，收集上清；或加IFN-γ培养24h再加DNV培养24h，收集上清，详见表2。所收集培养上清，均经加热56°C 30min处理，以除去IFN-γ，移置－20°C保存，备测IFN-α。

　　1.2.3　IFN-α的检测：通过细胞病变抑制试验^［3］检测IFN-α活性，以能抑制CPE（＋＋）的最高稀释度为终点。此读数为本室检测IFN-α的工作单位，而非国际标准单位。

　　2　结果

　　表1显示：单独M-CSF刺激不产生IFN-α；单独IFN-γ或单独NDV刺激，产生较低水平IFN-α；M-CSF＋NDV联合刺激产生IFN-α水平也较低；只有IFN-γ＋NDV联合刺激才能产生较高水平的IFN-α。此外，随着单核细胞培养时间延长，M-CSF组、IFN-γ组、NDV组和M-CSF＋NDV组诱生IFN-α水平均无明显升高趋势，而IFN-γ＋NDV组诱生IFN-α水平则逐渐升高，在1，3，7，12d产生IFN-α量与其它各组比均具显著性差异（P＜0．01）

表1　培养不同时间后M-CSF／IFN-γ／NDV单独或联合刺激

　　对单核细胞诱生IFN-α的影响（n＝5）

　　Tab 1　IFN-α production inducing with M-CSF／IFN-γ／NDV singly

　　or combinedly at different age of monocyte culture（n＝5）

Different age of 　　monocyte culture 　　（days）	IFN-α activity （u／0．1ml）（
	Medium	M-CSF	IFN-γ	NDV	M-CSF＋NDV 　　（NDV after 1 day 　　treatment of M-CSF）	IFN-γ＋DNV 　　（NDV after 1 day 　　treatment of IFN-γ）
1	＜2	＜3	4．8±1．1	13．6±3．6	15．2±5．2	57．6±8．8
3	＜2	＜2	6．0±2．5	14．4±6．1	16．0±4．8	102．8±26．7
7	＜2	＜2	7．6±0．9	16．0±5．8	16．8±4．4	115．2±28．6
12	＜2	＜2	8．8±3．0	20．0±5．7	18．4±5．4	192．0±64．0

　　表2显示，单独用M-CSF预处理，对IFN-α几乎无诱生作用；经过M-CSF预处理再与IFN-γ或NDV联合刺激诱生作用较弱，并且不随M-CSF预处理时间延长而诱生作用增强；经M-CSF预处理再与IFN-γ和NDV联合刺激，诱生作用最强，且随着M-CSF预处理时间延长，M-CSF＋IFN-γ＋NDV三者联合刺激诱生IFN-α水平均逐渐升高，在1，3，7，12d诱生IFN-α水平的量与其它各组比较均具有显著性差异（P＜0.01）。

表2 M-CSF预处理不同时间后加刺激剂（IFN-γ／NDV）对单核细胞诱生IFN-α的影响（n＝5）

　　Tab 2 IFN-α produced by monocyte after pretreatment of M-CSF，then stimulated by IFN-γ／NDV（n＝5）

Duration of M-CSF 　　pre-treatment 　　（days）	IFN-α activity （u／0．1ml）（
	Medium 　　（with M-CSF）	IFN-γ	NDV	IFN-γ＋NDV 　　（NDV after 1 day treatment of IFN-γ）
1	＜2	6．4±2．0	16．0±5．6	76．8±17．5
3	＜2	8．4±2．1	18．4±5．4	121．6±41．7
7	＜2	8．8±1．8	20．0±8．0	128．0±39．1
12	＜2	9．6±2．2	25．6±8．7	204．0±28．6

　　3　讨论　　M_ο-M_φ系统的发育，是从骨髓中的前单核细胞（6d）继续分化为成熟的单核细胞进入血液（1～3d），经过血循环定居到组织，称巨噬细胞^［4］（数天～数周）。随着细胞的分化成熟，其粘附能力、吞噬能力、细胞因子产生及细胞表面分子（包括F_C受体、CD分子、HLA分子）的表达等都逐渐增强。在体外组织培养中，圆形的单核细胞经3～7d培养后变成椭圆形、多角形或梭形的巨噬细胞，与免疫有关的表面分子渐丰，其合成和分泌细胞因子能力渐强。本文观察到体外培养时间越长，诱生IFN-α的能力越强，细胞培养2周所诱生的IFN-α水平明显高于1周的诱生水平。由此可见，只有成熟的巨噬细胞，才能诱生高水平的IFN-α，这与文献［2］报道一致。

　　M-CSF是由多种细胞产生的一类糖蛋白，能促进骨髓中干细胞增殖分化为单核吞噬细胞，并作用于循环的单核细胞和组织中的巨噬细胞，促进M_ο-M_φ的增殖和分化，是M₀-M_φ在体外长期生存的重要维持因子^［5］。IFN-γ在M_ο-M_φ生长和分化中起作用，目前公认IFN-γ是M_ο-M_φ系统中最有力的活化因子^［6］。本实验中，IFN-γ＋NDV二者联合刺激与M-CSF＋IFN-γ＋NDV三者联合刺激所诱生的IFN-α水平接近，无显著差异（P＞0.05）。提示：IFN-γ作为强而快的刺激剂发挥短程作用，M-CSF作为慢而弱的刺激剂发挥长程维持作用。

　　诱生α、β、γ3种干扰素的常用方法不同，通过病毒刺激外周血B细胞往往获得高效价IFN-α；polyI∶C刺激纤维母细胞获得高效价IFN-β；有丝分裂原如ConA、PHA等刺激外周血T细胞等则产生高价效IFN-γ。一般认为M_ο-M_φ是几乎难于产生IFN-α的细胞，但文献［7］报道coxsackievirus B3（CVB3）体外感染人血单核细胞导致杀细胞感染，同时诱生中等水平的IFN-α，这是一个特殊的例外。病毒导致单核细胞的杂细胞感染的例子确实很少，HIV虽能感染人单核细胞，但并不诱生IFN-α。据本实验观察，无论有无M-CSF的预刺激，单独NDV刺激不能导致M_ο-M_φ产生高水平的IFN-α，只有经过IFN-γ诱导细胞活化，NDV才能刺激产生较高水平的IFN-α，即二者联合作用效果极为明显。本文通过4种因素联合使用，M_O-M_φ（在特定条件下）诱生IFN-α可达相当高的水平，这为研究M_O-M_φ诱生IFN-α提供了参考。

　　作者简介　第一作者：女，36岁，硕士，讲师

　　参考文献

　　1　Warren MK，Palph R．CSF-1 stimulates monocytes factor production．J Immunol，1986，137：2281

　　2　Cantell K，Pirhonen J．IFN-γ enhances production of IFN-α in human macrophages but not in monocytes．J Interferon Cytokine Res，1996，16：461

　　3　黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术.北京：科学出版社，1990.266

　　4　Johnston RB．Monocytes and macrophages．New Engl J Med，1988，318（12）：747

　　5　Munn PH，Armstrong E．Regulation of monocyte differentiation in vitro．Cancer Res，1993，53：2603

　　6 Bohbot A，Eischen A，Feden C et al．U937 cell line：Impact of CSFs，IL-6 and IFN-γ on the differentiation and the Leu-CAM proteins expression．Exp Hematol，1993，21：564

　　7 Henke A，Mohr C，Sprenger H，et al．Coxsackievirus B3-induced production of tumor necrosis factor-α，IL-1β，and IL-6 in human monocytes．J Immunol，1992，148：2270

（1998-03-25收稿；1998-11-24修回）