血小板生成素转导鼠T淋巴细胞的增殖和分化

血小板生成素转导鼠T淋巴细胞的增殖和分化

免疫学杂志 1999年第1期第0卷 基础免疫学

作者：赵建增¹　郭子宽¹　梅英杰¹

单位：空军总医院空军临床分子生物学研究中心　北京 100036

关键词：血小板生成素　免疫调节T细胞　基因治疗

　　摘　要　为探讨TPO（血小板生成素）基因导入对T细胞增殖和分化影响的规律，将编码人TPO的质粒DNA60μg用脂质体包裹后，经肌肉途径转导入Balb／c小鼠体内。用CD4和CD8的特异性抗体标记小鼠各种免疫组织中的T细胞，借助流式细胞术分析它们的组成和变化。结果发现TPO基因导入使骨髓中的成熟和未成熟T细胞数量在经过短期下降后全部大幅度增多，胸腺未成熟T细胞增加；而脾脏和血液循环中成熟T细胞增多，特别是在血液中CD4阳性细胞的增加最为明显。这些特点大约在基因导入后两周内形成，并持续至少两周以上。本文所得的结果提示TPO是一种免疫促进分子，TPO基因导入后小鼠血液中多种淋巴因子的升高与它过量表达对T细胞的刺激有关。

　　中图号　Q592．1　R186　R331．1^＋44　R459．9

THROMBOPOIETIN cNDA TRANSFER PROMOTES T LYMPHOCYTE PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION IN MICE

Zhao Jianzeng，Guo Zikuan，Mei Yingjie

　　（Laboratory of Therapy，Center for Clinical Molecular Biology，General Hospital of Air Force，Beijing 100036）

　　Abstract To elucidate the effect of thrombopoietin（TPO） on the differentiation and proliferation of T lymphocytes via gene transferance，60μg human TPO plasmid DNA encapsulated with lipofectin （10μg／μl） was deli-vered into Balb／c mice．Monoclonal antibodies against murine CD4 or CD8 molecules were employed to directly stain the mononuclear cells from the immune tissues and were analyzed by flow cytometry．Mice treated with null-plasmid or saline were used as controls．Results showed that with the delivery of TPO cDNA，both mature and immature T lymphocytes in bone marrow increased in frequencies after a transient declination．Immature T lymphocytes in thymus increased while mature T lymphocytes increased mainly in spleens and blood circulation．Among them CD4^＋ T subsets selectively proliferated in the process．These changes appeared around 2 weeks after gene transfer and remained for at least 2 weeks．The data suggest that TPO might be an immuno-regulator and the cytokine over-production in gene transferved mice might be due to the activation of T lymphocytes，especially the helper subgroups．

　　Key words Thrombopoietin，Immunoregulation，T lymphocytes，Gene therapy

　　TPO（血小板生成素）是近年来发现的，被认为是对巨核细胞系发挥特异作用的一种重要造血调控因子，在对于各种表现为血小板生成能力降低的骨髓抑制的治疗中，人们寄与了它比较多的希望。我们利用质粒载体将人TPO cDNA经肌肉导入小鼠体内后，观察到了如血小板计数升高^［1］、骨髓巨核细胞集落形成单位增加^［2］、对化疗毒副作用的抵抗力增强^［3］等与多肽TPO分子相同的生物活性。但是在此过程中，血小板计数、骨髓巨核细胞集落形成单位和TPO表达水平的变化并不一致。故我们认为TPO在体内过量表达激活了对它的负调控反应机制，而免疫因子可能是其中的部分因素。经研究，TPO基因治疗鼠血液中IFN-γ、IL-2和TNF-α以不同的方式升高（待发表资料），提示TPO刺激了T细胞的活动。本文利用流式细胞分析术对该过程中T细胞的活动规律进行了研究。

　　1 材料与方法

　　1.1　质粒与体内转导 人TPO cDNA来源于胎肝，它的获得及真核表达质粒pcDNA3．hTPO的构建均由我们中心完成。它在小鼠体内能有效地表达人TPO，并体现出相应的生物学活性^［2］。同我们以前的方法相一致，本研究把60μg携带目的基因的质粒DNA用lipofection（Gibco BRL）包裹后直接注射到小鼠后肢骨骼肌中。每一时间组包含5只随机动物。以空载体和生理盐水分别做为对照。

　　1.2　单核细胞的制备　在TPO　cDNA导入后的不同时间，从眼底动脉放血，做抗凝处理。处死小鼠，立即用PBS（0．01mol／L，pH7．2～7．4）从股骨腔中冲洗出骨髓细胞；把脾脏和胸腺分别置于上述PBS液中，剪切、研磨，制成组织悬液。所有4种细胞分别加载于Ficoll液上，经800～1　200r／min离心30min，分离单核细胞。

　　1.3　双荧光抗体标记及流式细胞分析　上述单核细胞各1×10⁶～2×10⁶ PBS混悬液，在4°C避光环境中与FITC交联的抗小鼠CD4（L3T4）和PE交联的抗小鼠CD8抗体（Ly-2，Pharmingen），反应1h。经PBS漂洗后，把样品固定在70％乙醇溶液。保存于4°C避光环境中，直至分析。把样品用PBS漂洗，重悬，在FacStar（Becton　Dickinson）上进行分析。一组小鼠的同一种组织源性单核细胞混合后作为一个样品处理。每样品采集、分析5　000个细胞。

　　2　结果

　　表1是各组织在不同时期CD4^＋、CD8^＋细胞及其未成熟前体细胞（CD4CD8^＋）的比例；与不加任何处理的小鼠细胞相比，空载体组的各类T细胞亚型并无显著的规律性改变，故相关数据未列出。图1是各组织中淋巴细胞的双参数散点图。

　　从中可以看到如下的特点：①骨髓T细胞在TPO刺激后出现一个先减少后增多的变化；②胸腺以成熟前期细胞增多为主；③脾脏和血液中的T细胞以成熟细胞的增多为主，其中CD4^＋细胞的增加性变化尤为明显，而且血液中的这种改变更要早些。

　表1　各T淋巴细胞亚群的频数（％）

　　Tab　1Frequencies　of　T　lymphocyte　subsets（％）

Time 　　（day）		Bone　marrow		Thymus		Spleen		Blood
		Control	trial	Control	trial	Control	trial	Control	trial
3	CD4	6.54	4.04	21.3	24.08	42.66	45.0	56.06	58.18
	CD8	9.1	4.64	13.24	9.52	7.2	13.02	16.18	14.64
	CD4CD8	4.6	2.58	26.49	26.82	8.12	5.06	8.42	5.02
7	CD4	2.02	1.8	19.74	19.5	28.08	31.44	40.56	37.96
	CD8	3.06	4.76	18.96	17.64	13.24	14.68	16.38	16.42
	CD4CD8	1.36	1.22	45.58	46.4	9.88	10.6	7.68	7.72
14	CD4	1.00	2.76	25.34	22.78	30.62	32.0	44.16	61.92
	CD8	1.36	2.94	19.48	19.16	11.5	14.28	18.16	17.54
	CD4CD8	0.16	0.66	20.66	32.54	7.0	11.2	8.76	5.9
21	CD4					23.36	33.44	36.1	42.1
	CD8					5.78	6.7	4.96	5.76
	CD4CD8					14.92	9.86	8.56	6.38
28	CD4					29.26	37.34	44.98	52.58
	CD8					5.94	6.06	11.16	12.38
	CD4CD8					14.52	20.62	7.4	7.22

　　图1　T淋巴细胞的双参数散点图

　　Fig　1 Dual parameter dot-plot of the T lymphocytes

　　FL-1—CD4-FITC；FL-2—CD8-PE

　　3　讨论

　　越来越多的资料说明TPO是一多能分子，特别是它具有免疫调节活性。内皮细胞是一类重要的免疫辅助细胞，Kubota等人报道TPO可以刺激内皮细胞增殖并且促进该细胞分泌细胞粘附分子^［4］。Fujimoto等人还发现TPO在体外能间接刺激干扰素的产生^［5］。我们的研究发现，TPO基因转导鼠的脾脏出现类似免疫增强性活动中的变化^［6］。在质粒介导的TPO过量表达小鼠，血液循环中IFN-γ、IL-2和TNF-α呈现不同模式的增加（待发表材料）；其中IFN-γ和TNF-α参与对血小板生成的调节^［7～9］，但是IL-2的意义目前还知之甚少。它们均可由T细胞，特别是辅助性T细胞产生。我们认为这些因子的增加预示着TPO的新的生物活性。本研究发现在TPO基因导入后，各类免疫组织内T细胞亚型的比例均有增高，从细胞学的角度证实了我们关于TPO具有免疫调节活性的推论。

　　TPO基因导入后，它在很短的时间内就开始表达，并在48h后出现血小板计数升高，各种细胞因子的变化已经开始。胸腺中未成熟T细胞的数量增多提示在此过程中的分裂周期加快。而脾脏和血液中成熟T细胞数的增加说明它的成熟加快，同时说明TPO对T细胞的促进性刺激作用于T细胞发育的全过程，但这种作用对细胞种类有选择性，明显的是辅助性T细胞偏向性增加。与其它组织不同的是，早期骨髓T细胞数不升反降。目前对这一变化的机理还无法做出推测。

　　辅助性T细胞的活化将提高机体的免疫应答能力，因而TPO对各种免疫机能低下疾病都有潜在性的治疗价值。最近，Frey等发现由腺病毒介导的TPO基因导入激发了抗TPO抗体产生^［10］。因而有理由怀疑本研究所观察到的可能属于TPO高表达诱发的机体抗TPO免疫反应的一部分，而不是TPO具有免疫刺激活性。我们还未对此加以研究。不过，Semple等曾报导多数急性和慢性自身免疫性血小板减少性紫癫病人血小板抗原的表达增加，但仅有部分病人表现早期Th0和Th1　CD4^＋细胞活化^［11］。因而，CD4^＋细胞活化并不是自身免疫反应的必然形式。据我们最新的研究，TPO基因导入使小鼠抗肿瘤的能力大幅度增强（待发表资料），其中可能涉及多种机理，这正是本研究的意义之所指。当然，要认清TPO对免疫系统的作用方式还需要更深入的研究。

　　第一作者：男，36岁，博士，副主任医师

　　参考文献

　　［1］　Zhao JZ，Liu L，Li Y．Promotion of platelet production by hTPO cDNA injection（letter）．Heamatologica，1997，83∶383

　　［2］ 赵建增，刘 丽，陈惠仁，等.血小板生成素基因在体内的表达及对造血祖细胞增殖活性的影响.中国生物化学与分子生物学学报，1998，14（2）：117

　　［3］ 赵建增，刘 丽，王晓平，等.TPO基因注射用于小鼠肿瘤辅助性治疗的初步研究.白求恩医科大学学报，1996，22（专辑）：1

　　［4］ Kubota Y，Kashima M，Koishi M，et al．Effects of thrombopoietin on the proliferation and cell adhesion molecule expression of human endothelial cells（abstract）．Exp Hematol，1996，24：1069

　　［5］ Fujimoto T，Katsutani S，Fujii T，et al．Thrombopoietin induces the expression of one of the interferon-inducible gene family，9-27：an analysis of thrombopoietin action（abstract）．Blood，1996，88（10 suppl．1）：63a

　　［6］ 赵建增，刘 丽，李 奕，等.血小板生成素基因注射促进血小板生成作用的实验研究.军医进修学院学报，1998，19（1）：40

　　［7］ Carlo-Stella C，Cazzola M，Ganser A，et al．Synergistic antiproliferative effect of recombinant interferon-gamma with recombinant interferon-alpha on chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitor cells（CFU-GEMM，CFU-MK，BFU-E，and CFU-GM）．Blood，1988，72∶1293

　　［8］ Muraoka K，Tsuji K，Yoshida M，et al．Thrombopoietin-independent effect of interferongamma on the proliferation of human megakaryocyte progenitors，Br J Hematol 1997，98：265

　　［9］ Liu RY，Fan C，Mitchell S，et al．Tumor necrosis factor （TNF）-α stimulates the proliferation of the human factor-dependent megakaryocytic cell line，MO7E（abstract）．Exp Hematol，1996，24：1071

　　［10］ Semple JW，Milev Y，Cosgrave D，et al．Differences in serum cytokine levels in acute and chronic autoimmune thrombocytopenic purpura：relationship to platelet phenotype and antiplatelet T-cell reactivity．Blood，1996，87：4245

　　［11］ Frey BM，Rafii S，Teterson M，et al．Adenovector-mediated expression of human thrombopoietin cDNA in immune-compromised mice：Insights into the pathophysiology of osteomyelofibrosis．J Immunol，1998，160：691

（1998-04-14收稿；1998-07-03修回）