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摘要：角膜缘干细胞是一种独特类型的细胞，其增殖分化有特殊机制调节。对此机制进行研究，需先用一定方法分离纯化角膜缘干细胞，然后采用克隆培养及相应的增殖分化评价方法进行评价。角膜缘干细胞增殖分化受局部微环境调节。血清、各种细胞因子及基质细胞对其增殖分化均有调节作用。
角膜缘干细胞（stem cell,SC）是位于角膜缘基底上皮层的特殊细胞，其生理生化特点已基本研究清楚[1-3]。临床上，利用干细胞理论可解释诸如先天性无虹膜、眼化学烧伤等疾病的发病机制[4，5]。应用自体、异体角膜缘干细胞移植治疗严重的眼表疾病已取得了显著效果[6-8]。但是，干细胞在何种状态下开始分裂？分化程度如何控制？即对干细胞增殖分化调控机制的研究刚刚起步，对此调控机制的研究有独特方法。现就对此研究方法及最新研究进展综述如下：
一、角膜缘干细胞分离与纯化
角膜缘干细胞存在于角膜缘上皮基底层[9]，此处的基底细胞并非都是干细胞。所谓表皮增生单位（epidermal proliferate units.EPU），是由10-15层细胞构成，只是基底细胞能够增殖，而在一个EPU中有10-11个基底细胞，中间的一个是干细胞，其余的相当于短暂扩充细胞（transient amplifying cells.TAC）。在对干细胞增殖分化的研究中，需先采用特殊方法获得纯的干细胞，然后再通过培养，研究其增殖分化机制。对于干细胞的分离纯化方法已有不少尝试。
Tseng等[10]观察到，鼠在系统应用5-氟尿嘧啶（5-FU）后骨髓细胞明显减少，而原始造血干细胞增多。这提示5-FU可减少快速增殖TAC细胞，而保留静态的干细胞。因角膜上皮可快速自我更新，并对5-FU毒性特别敏感，5-FU毒性选择作用于基底增殖细胞，可导致全部基底层以上细胞层的丧失，而使慢周期干细胞得以保留。据此，Tseng在兔结膜下注射5-FU20mg/眼，可选择性减少角膜TAC细胞，有效获得丰富的较纯的干细胞。
Kruse等[11]研究表明，将整个角膜上皮及周围3mm范围的角膜角缘和结膜上皮取下后，用n-庚醇液环形擦试。处理时间不同，残留的细胞量不同。在处理120秒时，仅保留角膜缘上皮粘附，而角膜结膜上皮均被去除。可见，用此方法能获得较纯的干细胞。
kruse等[12]通过消化方法以获得单个的干细胞而进行培养。在距离巩膜缘后2mm处剪下兔眼角巩膜片，去除内皮和虹膜。用10mm环钻取下角膜缘组织，用DispaseⅡ液消化3小时，去除松散的上皮层，再通过.01％trypsin和0.02EDTA在无钙的EM的二次消化10分钟，即可将细胞分离为单个。
另外，尚有人利用毛地黄皂苷选择性去除浅层角膜上皮，暴露基底细胞层[13]。
总之，各种分离细胞方法均有效，研究过程中将它们有机地结合，可提高分离效率及纯度。
二、无血清单细胞克隆培养角膜缘干细胞及评价方法
对于角膜缘干细胞增殖分化调控机制的研究，多采用离体培养方法进行。角膜缘干细胞离体后培养，虽然在一定程度上改变其固有的生物学特性，但仍有一种有效的研究方法。以往的细胞培养均加入血清等天然培养成分[11，14]，血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促粘附因子及其它活性物质等。添加血清虽有利于细胞生长，但不明成分也增多了，对分析实验结果增加了困难，尤其在对增殖分化调控的研究中，无法分析实验结果。针对这一问题，Kruse等[5]最早提出角膜缘干细胞无血清单细胞克隆培养方法，并利用此方法，对角膜缘干细胞的增殖分化调控机制做了系统化的研究。这种无血清单细胞克隆培养基是在MCDB151基础培养基中加入胰岛素、转铁蛋白、氢化考的松、硒、钙、磷酸乙醇胺等。这种培养条件适合TAC细胞增殖，而干细胞在此培养条件下保持静态。可见，此培养方法可用来研究调节干细胞转化为TAC细胞的因子。