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抗cTnT抗体对实验性缺血心肌的定位诊断
免疫学杂志 2000年第1期第16卷 技术与方法
作者：李志梁 钱洪津 陆青 王素华
单位：李志梁（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）； 钱洪津（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）； 陆青（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）； 王素华（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）
关键词：心肌肌钙蛋白T；单克隆抗体；缺血心肌；诊断
摘 要：目的 制备抗心肌肌钙蛋白T（cTnT）单克隆抗体，并用免疫组化方法诊断实验性缺血心肌部位、程度。方法 常规免疫Balb／c小鼠，经细胞融合、克隆化，筛选抗cTnT杂交瘤细胞株，制备高效价、特异的单克隆抗体，采用ABC染色，分析缺血心肌部位及程度。结果 在8株杂交瘤细胞株中选出IF9作为第一抗体。ABC染色后坏死区为粗颗粒棕褐色聚集着色，缺血区为小颗粒浅棕色着色，正常心肌不着色。结论 应用抗cTnT单克隆抗体能特异诊断缺血心肌的部位、程度。
中图分类号：R392.31 文献标识码：A
The localization diagnosis of experience ischemic myocadium by anti-cardiac troponin T （cTnT） monoclonal antibody
LI Zhi-liang，QIAN Hong-jin，LU Qing，WANG Su-hua
（Department of Cardiovascular，Zhujiang Hospital，the First Military Medical University，Guangzhou 510280，China）
Abstract：Objective To develope anti-cardiac troponin T（cTnT） monoclonal antibody and identify region and degree of ischemic myocardium by immunohistochemistry．Methods Balb／c mice were immunized with cTnT．The specific，high-title monoclonal anti-cTnT antibody were developed after cell fusion，cloning and screening．The localization and degree of ischemic myocardium were analyzed by ABC stain．Results The IF9 were selected as first antibody within eight hydridoma cell lines．After ABC stained，the area of necrosis stained bigger dense granular material，while ischemic myocardium remained uniformly small granular．Normal myocardial did not be stained．Conclusion The localization and degree of ischemic myocardium may be diagnosis by the specific monoclonal anti-cTnT antibody．
Key words：cardiac troponin T；monoclonal antibody；ischemic myocardium；diagnosis▲
心肌肌钙蛋白T（cTnT）是心肌肌钙蛋白的亚单位之一，参与心肌兴奋-收缩偶联。近年来，应用cTnT的血清学检测手段，能早期、敏感、特异性诊断临床心肌缺血、损伤性疾病，已成为90年代急性心肌梗塞生化诊断的重要标志［1］。本文在成功制备抗cTnT单克隆抗体的基础上，通过免疫组化技术观察实验性大鼠急性梗塞和缺血的心肌cTnT定位分布，评估cTnT在缺血心肌部位、程度的定位诊断意义，为今后其临床应用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 苯甲基磺酰胺（PMSF），DDT，Sigma产品；丙烯酰胺，双异丙烯酰胺，德国Mech产品；福氏完全佐剂，Sigma产品；羊抗鼠IgG-HRP，北京军事医学科学院产品；Sapharose-4B，Sigma产品；SPA，Sigma产品；ABC试剂盒，华美生物工程公司；其余均为国产分析纯。Balb／c雌性小鼠6周龄10只，雄性SD大鼠（200±20g）10只，第一军医大学动物中心提供。
1.2 cTnT的提取、纯化 由本室从志愿者捐献的心肌中提取［2］。经分子量、紫外吸收光谱、免疫原性及氨基酸组分鉴定。
1.3 cTnT单克隆抗体制备［3］ 首次免疫cTnT 100μg，卡介苗2.5mg与等体积福氏完全佐剂混合，注入6周龄Balb／c小鼠腹腔，此后每隔1周cTnT 50μg加福氏不完全佐剂腹腔内注射，共4次（细胞融合前3次，加强免疫1次）。取免疫小鼠脾细胞与预制备的sp2／0骨髓瘤细胞按5∶1比例融合，而后选择性培养，间接ELISA筛选出抗cTnT阳性细胞株，克隆化后收集IF9杂交瘤细胞株，注入预处理后的成年雌性Balb／c小鼠诱生腹水。
1.4 抗cTnT单克隆抗体纯化 将收集的腹水离心、去脂、去沉淀后，过Sapharos-4B层析柱，收集第一峰液体，测定蛋白含量及SDS-PAGE电泳纯度测定，间接ELISA测定效价。
1.5 大鼠心肌梗塞模型制备 取SD雄性大鼠，3％戊巴比妥钠（40mg／kg）腹腔麻醉。经口腔连接动物呼吸机，四肢皮下连接心电图电极。于左前第4肋间隙开胸，充分暴露心脏及左冠状动脉，轻掀左心耳，在其下缘用0000线结扎冠状动脉前降支。ECG示ST段弓背抬高（预试验中经心肌病理证实）。术后关胸饲养24h。
1.6 缺血心肌的免疫组化研究［4］ 正常和急性心肌梗塞大鼠再次麻醉，行气管插管人工辅助呼吸，分离腹主动脉，行腹主动脉插管，剪开右心耳，生理盐水充分灌注后，用多聚甲醛在体灌注，固定、取材，5μm切片、染色。HE染色：经二甲苯及不同浓度酒精脱水洗涤，伊红染色，中性树胶封闭。免疫组化ABC染色：先经二甲苯脱水，过氧化物酶阻断，加入抗cTnT单克隆抗体（1∶200），4°C湿盒过夜后，加生物素标记的羊抗鼠IgG，加链霉亲和素-HRP显色、复染，最后中性树胶封闭。
2 结果
2.1 抗cTnT单克隆抗体的特性 本实验共获得8株能高度分泌抗cTnT单克隆抗体的细胞株。其中IF9效价为2.4×10－8，Ig亚类鉴定为IgG，与cTnI、肌凝蛋白轻链抗原无交叉反应。
2.2 抗cTnT对缺血和坏死心肌定位观察 正常心肌不着色，缺血心肌着色较浅，呈散在孤立状。坏死心肌主要为不均一性、聚集成团，棕褐色着色（见图1～图3）。同一组织作HE染色对照可见坏死区心肌细胞核部分溶解消失，部分破裂成碎片或固缩状。细胞结构明显破坏，大量炎性细胞浸润（见图4）。
图1 透壁坏死心肌组织呈深棕色，聚集成团
Fig1 Transmural necrosis myocardial tissue stained dark-brown，dense gramele（ABC×120）
图2 缺血心肌组织呈浅棕色，孤立状（△），正常心肌不着色（▲）
Fig2 Ischemic myocardia tissus stained light-brown，iso-leted gramele（△），normal yocardium did not be staind （▲）（ABC×120）
图3 正常心肌免疫组化染色
Fig3 Normal myocardium immunohistochemistry staining（ABC×120）
图4 透壁坏死心肌细胞结构破坏，纤维紊乱，炎症细胞浸润
Fig4 Transmural necrosis myocardial cell structure dis-pated，fiber disorder，inflammatory cell infiltration（HE×120）
3 讨论
检测血清cTnT水平诊断急性心肌梗塞、不稳定型心绞痛等心肌缺血损伤疾病是90年代发展起来的新技术，具有早期、敏感、特异性等优点，优于现行的磷酸肌酸激酶（CK）和同工酶（CK-MB）［5～8］。我们在建立链霉亲和素-生物素ELISA血清cTnT检测方法的同时（另文发表），试图了解抗cTnT单克隆抗体在心肌缺血损伤部位、程度的诊断意义。从本实验结果中可以看出，大鼠急性心肌缺血后，由于缺血程度不一，心肌细胞膜和结构出现不同程度的破坏，缺血区主要以孤立、散在浅棕色为主，而坏死区则以弥散性、聚集成团、棕褐色为主。主要机制可能是：cTnT在肌原纤维占98％，在胞液仅占2％。心肌坏死时，作为结构蛋白cTnT，绝大多数从肌丝上解离或破坏，与相对应的抗体结合成聚集状。缺血轻微时，cTnT降解、破坏亦轻微，与相应的抗体结合少，故表现散在、轻度着色，正常心肌则完全不着色。因此，应用抗cTnT抗体能较好地反映坏死、缺血心肌部位、程度［9］。
基础心血管研究中，对在体的微小心肌损伤的定位评估常缺乏有效的观察手段。即使在临床工作中，应用ECT来评价心肌微小缺血性损伤，其敏感性、特异性亦较低。选择心肌特异蛋白进行特殊标记，以准确反映微小心肌损伤的部位、程度，具有重要的临床意义。cTnT是心肌的特异蛋白，具有高度的器官特异性，无种属特异性。本试验将为以后的标记化cTnT抗体在在体缺血心肌定位显像的应用中奠定理论基础。■
基金项目：军队“九五”医药卫生科研青年基金（97031055）和广州市重点项目基金（9724806）资助项目
作者简介：李志梁（1958-），男，福建人，副教授，硕士，主要从事冠心病早期诊断和防治的研究。
参考文献：
［1］ 杨振华．应考虑在缺血性心脏疾病中使用一些新的生化标记物［J］．中华心血管病杂志，1997，25：327～329．
［2］李志梁，付朝平，陆 青，等．人心肌肌钙蛋白T的纯化和鉴定［J］．第一军医大学学报，1996，16：130～131．
［3］KATUS HA，LOOSER S，HALLERMAYER K，et al Development and in vitro characterization of a new immun．noassay of cardiac troponin T［J］．Clin Chem，1992，38：386～393．
［4］周德山．免疫酶细胞化学［A］．见：蔡文琴，王伯潭．主编．实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术［M］．成都：四川科学技术出版社，1994．72～78．
［5］KATUS HA，REMPPIS A，NEUMANN FJ，et al．Diagnostic efficiency of troponin T measurements in acute myocardial infraction［J］．Circulation，1991，83：902～912．
［6］MAIR J，DIENSTL F，PUSCHENDORF B．Cardiac troponin T in the diagnosis of myocardial injury ［J］．Crit Rev Clin Lab Sci，1992，29：31～57．
［7］ALONSOZANA GL，CHRISTENSON RH．The case for cardiac troponin T：marker for effective risk stratification of patient with acute cardiac ischemia ［J］．Clin Chem，1996，42：803～808．
［8］LINDAHL B，VENGE P，WALLENTIN L，et al．Troponin T identifies patients with unstable coronary artery diseases who benefit from long-term antithrombotic protection［J］．JACC，1997，29：43～48．
［9］VOSS EM，SHARKEY SW，GERNERT AE，et al．Human and canine cardiac troponin T and Creatine Kinase-MB distribution in normal and diseased myo-cardium［J］．Arch Pathol Lab Med，1995，119：799～806．
收稿日期：1999-04-12
修回日期：1999-09-30