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猪卵泡液提取物制备人抑制素α单抗的研究
免疫学杂志 2000年第1期第16卷 基础免疫学
作者：高晓东 丁明杰 张志坚 宫亚欧 汤黎明 夏辉明 鲁桂琛 孙颖
单位：高晓东（河南医科大学病生学教研室，河南 郑州 450052)； 张志坚（河南医科大学病生学教研室，河南 郑州 450052)； 宫亚欧（河南医科大学病生学教研室，河南 郑州 450052)； 汤黎明（河南医科大学病生学教研室，河南 郑州 450052)； 夏辉明（河南医科大学病生学教研室，河南 郑州 450052)；
关键词：人抑制素； 单克隆抗体； 免疫组化； 肿瘤
摘 要：目的 制备人抑制素α（INHα）亚基多肽单克隆抗体（McAb）。方法 以猪卵泡液粗提物为免疫原，免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与NS-1小鼠骨髓瘤细胞融合。杂交瘤细胞用人工合成的人抑制素α亚基37～65片段包被，间接ELISA法筛选。结果 获稳定分泌抗人抑制素α亚基37～65片段单抗细胞3株。结论 免疫学和免疫组化的结果表明3株细胞有特异性和实用性。抗体可用于人的正常组织及部分肿瘤组织免疫组化研究。
中图分类号：R392-33 文献标识码：A
Generation and characterization of three monoclonal antibodies against human INH-α raised
with extracted substance of PFF
GAO Xiao-dong ZHANG Zhi-jian GONG Ya-o TANG Li-ming XIA Hui-ming （Department of Pathophysiology，Henan Medical University，Zhengzhou 450052，China)
DING Ming-jie (Department of Histology and Embryology，Henan Medical University，Zhengzhou 450052，China)
LU Gui-chen SUN Ying
(Pharmacology，Medical Academy of China，Beijing 100050）
Abstract：Objective To prepare monoclonal antibody against human INH-α（McAb）．Methods BALB／c mice were immuned with the extracted substance of porcine follicular fluid （PFF）． Then the spleen cells were fused with mouse myeloma cells NS-1． The hybridoma culture supernants were screened by indirect ELISA in which artificial synthetic human inhibin α subunit 37～65 fragment was used as antigen．Results Three hybridoma cell lines against inhibin α subunit have been raised．Conclusion According to the immunological and immunohistochemical identification， we concluded that three hybridoma cell lines have high sensitivity and high specificity． These antibodies can be used in immunohistochemistry study of the normal and some tumor tissues in human， as well as in procine and rat．
Key words：human inhibin； monoclonal antibody； tumor； immunohistochemistry▲
抑制素（inhibin，INH）分子量32KD，由α和β亚基借二硫键构成INHA（α β A），INHB（α β B）。INH是由性腺产生和分泌的糖蛋白激素。可以反馈地抑制垂体卵泡刺激素（FSH）的分泌。血清INH水平随年龄、生殖周期的变化而变化，可能成为一种新的判断各种状态下卵巢和睾丸功能的指标［1］。从1989年有人提出抑制可能成为肿瘤的标志物（Marker）以来，国外已有广泛研究［2］，国内研究很少。
1 材料和方法
1.1 动物 BALB／c纯系小鼠，雌性，8周龄，体重20g左右，由河南医科大学实验动物中心提供。
1.2 试剂 制备单抗常规试剂。
1.3 细胞 NS-1骨髓瘤细胞，天津肿瘤研究所赠送，本室常规传代培养。
1.4 抗原 猪卵泡INH粗提物由丁明杰等提取，INH α纯品由鲁桂琛等合成，INH 32KD纯品由澳大利亚墨尔本大学BURGER HG教授赠送。
1.5 抗原制备
1.5.1 猪卵泡液抑制素的提取［3］：猪卵泡液取自刚离体的猪卵巢，注射器抽出卵泡液，立即9 500g、4°C离心10min，去除颗粒细胞及杂质，取上清－30°C贮存。收集卵泡液30ml后，9 500g、4°C离心10min去除沉淀，每1ml上清加9ml葡聚糖包被的活性碳23°C孵育10min，再4°C孵育搅拌，加入0．05PEG（W／V）去除细胞毒类。9 500g、4°C离心30min，上清制成冻干粉，并测蛋白含量及甾体类去除情况（测雌二酮、孕酮、睾丸酮含量）。
1.5.2 INH α（37～65）合成：采用固相多肽合成高压液相纯化，氨基酸序列分析确定序列［4］（由鲁桂琛等完成）。
1.6 免疫 用粗抗原免疫。基础免疫每只小鼠用600μg蛋白抗原，2周后用600μg粗抗原加强免疫，1周后用50μg抗原直接注入脾脏，4d后用于细胞融合。
1.7 单抗制备［5］ 采用PEG（1500）细胞融合法，HAT选择培养，以人INH α（37～65）间接ELISA法筛选。阳性孔3次有限稀释法克隆化培养，用降植烷体内诱生法制备含单抗腹水。
1.8 抗体的纯化［5］ 采用正辛酸法纯化抗体。
1.9 杂交瘤细胞株的鉴定
1.9.1 杂交瘤细胞株染色体检查［5］：采用秋水仙素阻抑——低渗处理法。
1.9.2 抗体特异性鉴定：选择了8种［6］可能与抑制素有交叉反应的抗原：FSH，LH（黄体生成素），AFP（甲胎蛋白），hPL（人胎盘泌乳素），E2（雌二醇），hCG（人绒毛膜促性腺激素），CEA（癌胚抗原）；PRL（催乳素）。将不同稀释度的3株细胞纯化单抗与人血清4°C孵育过夜，并用PBS与人血清孵育做对照（n＝8），用放免或酶免方法测孵育后两组样品中以上8种抗原含量的差异。32KD INH 1μg／ml包被，作为阳性对照。INH α（1～32）1μg／ml 包被，作为阴性对照。
1.9.3 抗原结合位点测定：ELISA单抗相加试验，计算相加指数（AI）［7］。
1.9.4 抗体相对亲和力测定：参见文献［7］。
1.9.5 抗体效价测定：用间接ELISA法测定系列稀释含单抗的腹水中抗体效价［7］。
1.9.6 免疫球蛋白亚类鉴定：免疫双扩散法［5］。
1.9.7 IA5单抗抑制ELISA试验［8］：采用竞争ELISA法，INH 1μg／ml 包被，A5腹水1∶1 000稀释。将猪卵泡原液（PFF）、人卵泡原液（HFF）、绝经期妇女血清（PMS）分别做倍比稀释，然后与稀释的腹水1∶1混合4°C过夜，以混合液为一抗间接ELISA法测OD值（λ＝492nm）。
1.10 免疫组化定位 采用ABC法。共收集猪、大鼠正常卵巢组织；肿瘤组织周围结构正常的人卵巢组织；不育做睾丸活检结构正常的人睾丸组织；大鼠睾丸各2例及部份经病理学诊断为肿瘤的标本（标本来自河南医科大学病理教研室）。
2 结果
2.1 抗原粗提 经前述方法处理后，几乎0.99甾体类物质被除去，冻干粉蛋白为每支7.6 mg；非冻干粉蛋白为8．3 mg／ml。
2.2 纯品INH（37～65）的氨基酸序列 Ile-Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Glu-Arg-Trp
-Ile-Val-Tyr-Pro-Pro-Ser-Phe-Ile-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gly-Gly-Cys-Gly-Leu。
2.3 融合率及阳性率 获得3株稳定分泌抗人INH α 37～65片段单抗的杂交瘤细胞株，命名为IA5，IV3C，V5G。融合率0.791；阳性率0.0209。
2.4 亚克隆 经3次有限稀释法亚克隆，第3次亚克隆所有长出孔抗体均阳性。
2.5 染色体分析 IA5，IV3C，V5G分别为：102±1．05，102±1．037，102±1．46。
2.6 抗体特异性鉴定 人血清加入单抗组和加入PBS组相比，前述8种抗原两组间含量差异小于0.05。INHα亚基1～32片段包被ELISA试验阴性，INH32KD包被ELISA实验阳性。
2.7 抗原结合位点 IA5＋IV3C、IA5＋V5G、IV3C＋V5G的AI值分别为0．5318、0.5328、0.5162。3株细胞可能识别同一位点。
2.8 抗体相对亲合力 IA5＞IV3C＞V5G。
2.9 抗体效价 IA5、IV3C、V5G腹水抗体效价分别为1×10－5，5×10－5，1×10－3。
2.10 免疫球蛋白亚类 3株细胞抗体都是IgG1型。
2.11 IA5单抗抑制ELISA 见图1。
| 图1 IA5单抗抑制ELISA实验结果
Fig1 Result of IA5 McAb Inhibin ELISA Test 2.12 免疫组化定位 人及猪、大鼠正常卵巢组织中卵泡壁颗粒细胞呈抑制素样免疫反应，卵泡膜细胞呈弱阳性，黄体强阳性反应。人正常睾丸及大鼠正常睾丸组织中支持细胞和间质细胞呈阳性，精原细胞和精母细胞也呈阳性反应，其它呈阴性（见图2）。 |
图2 人睾丸支持细胞中INH-α样免疫反应 ×400
Fig2 Immunoreaction of inhibin α-subunit in normal
human Lidig cells ×400
3 讨论
为观察猪卵泡液甾体类物质去除情况，选择了雌二醇、孕酮、睾丸酮为代表用放免方法测定了提取前、后这3种物质的量，结果很理想。免疫动物时比较了在相同的蛋白含量下，冻干粉和非冻干粉的免疫效果，非冻干粉去除了PEG（分子量6000），结果冻干粉免疫动物的血清抗体效价比非冻干粉高近0.81（OD值），可能是PEG增强了免疫效果。
LEE VWK 1986年用孕马血清激素预处理大鼠，取其卵巢做为抑制素来源，用免疫组化方法筛选，在世界上首次建立了分泌抑制素单抗的细胞株，随后又有实验室利用合成的人抑制素α亚基或β亚基片断制备单抗。但是它们的抗体都是针对小的肽片断的。作者利用猪卵泡液做为抑制素的来源相对容易且抗原量礧，以合成INH α片断筛选制备针对抑制素大分子的单抗。即可有α亚基也可有β亚基，但用非纯品免疫动物制备单抗困难较大，阳性率低，在纯品来源少时，也不失为一种好办法。国外资料显示有8种抗原可能与抑制素单抗有交叉反应［6］。抗体特异性鉴定时，由于这8种抗原纯品难觅，无法直接用ELISA法鉴定，用测它们含量的放免或酶免试剂盒，将同一人血清分两组，即与抗体孵育组和与PBS孵育组，两组间8种抗原的含量差异小于0.05（抗体孵育组抗原含量－PBS孵育组抗原含量／PBS孵育组抗原含量），说明单抗与8种抗原的交叉反应率小于0.05。这样就为在无抗原纯品，无法用ELISA法测定交叉反应开辟了一个新途径。
免疫组化结果证明作者制备的抗体有中和组织中INH 样物质的能力。INH 单抗可用于性腺肿瘤的免疫组化定位研究，精原细胞瘤和卵巢颗粒细胞瘤阳性率较高，尤其是卵巢颗粒细胞瘤，8例全部阳性，这些与国外报道一致［2］。免疫组化研究中，原本是用食管癌和胃癌做阴性对照，结果意外发现1例胃癌阳性（见图3）。有关抑制素在胃癌中有表达国内、外尚无报道，INH α在哪类胃癌中有表达，阳性率怎样，有待进一步研究。国外文献报道抑制素成熟的α亚基在人、羊、猪、大鼠间具有0．84～0．95的序列同源性［4］。这是能用猪卵泡液粗提物免疫小鼠，用人INH α筛选、制备出抗人INH α亚基的基础。
图3 人胃癌组织中INH-α样免疫反应 ×200
Fig3 Immunoreaction of inhibin α-subunit in humangastric cancer cells ×200■
基金项目：卫生部科学基金（96-1-065）和河南省科委攻关计划（971200311）资助项目
作者简介：高晓东（1962-），女，辽宁盖州人，讲师，硕士，主要从事单抗应用研究。
作者单位：丁明杰(河南医科大学组胚学教研室，河南 郑州 450052)； 鲁桂琛(中国医学科学研究院药物研究所，北京 100050）；孙颖(中国医学科学研究院药物研究所，北京 100050）
参考文献：
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收稿日期：1999-03-23
修回日期：1999-08-11