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抗HCMV不同多肽McAb的鉴定
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 技术与方法
作者：严华 申厚风 李国才
单位：严华（扬州大学医学院微生物学教研室，江苏 扬州 225001）；申厚风（扬州大学医学院微生物学教研室，江苏 扬州 225001）；李国才（扬州大学医学院微生物学教研室，江苏 扬州 225001）
关键词：单克隆抗体；人巨细胞病毒；多肽
［摘 要］ 目的 为了将单克隆抗体（McAb）用于诊断技术，我们首先建立了13株抗人巨细胞病毒（HCMV）的McAb，选取6株McAb作进一步鉴定。方法 这6株McAb的鉴定主要采用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验等方法。结果 间接免疫荧光试验表明：McAb 8B8相应的多肽为早期抗原；而McAb 7B4、7D7、7E7、7E11、8D6的相应病毒多肽为晚期抗原。免疫印迹试验的结果表明：McAb 7B4、7D7、7E7、7E11、8B8、8D6相应的病毒多肽分子量分别为46、150、38、51、72、65 kd。结论 McAb 8B8可不用于HCMV的快速诊断。
［中图分类号］ R392-11 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0297-03
Identification of McAb against different HCMV polypeptides
YAN Hua，SHEN Hou-feng，LI Guo-cai
（Department of Microbiology，School of Medicine，University of Yangzhou，Yongzhou 225001，China）
［Abstract］ Objective To apply monoclonal antibody（McAb） to diagnostic techniques，13 McAbs against different human cytomegalovirus（HCMV） polypeptides were established and 6 McAbs（7B4，7D7，7E7，7E11，8B8，8D6） were selected for further identification.Methods 6 McAbs were mainly identified by indirect immunofluorescence reaction and immunoblot analysis.Results Indirect immunofluorescence reaction of 6 McAbs with HCMV infected cells at different time showed that McAb 8B8 is against the early antigen of HCMV，while McAbs 7B4，7D7，7E7，7E11，8D6 are against the late antigen of HCMV.Immunoblot analysis revealed 6 McAbs are directed against different HCMV polypeptides with molecular weight of approximately 46，150，38，51，72，65 kd．Conclusion McAb 8B8 can be used for rapid assay of HCMV．
［Key words］ McAb；HCMV；polypeptide
人对人巨细胞病毒（HCMV）普遍易感，多呈非显性感染、亚临床和潜伏感染。但对胎儿和免疫功能低下者具有高度危险性［1］。这已经引起了医学界的重视。抗HCMV-单克隆抗体（McAb）的研制，对于HCMV感染的诊断、预防和治疗具有实际意义［2］。本文采用杂交瘤技术建立了13株分泌HCMV-McAb的杂交瘤细胞，从中选取效价较高的McAb 7B4、7D7、7E7、7E11、8B8、8D6采用免疫荧光试验、免疫印迹试验等作了进一步的鉴定。
1 材料与方法
1.1 6株杂交瘤细胞的制备方法 见参考文献［1］。
1.2 6株杂交瘤细胞的染色体分析 采用常规方法。
1.3 6株杂交瘤分泌McAb的稳定性研究 采用ELISA和血凝试验。
1.4 6株McAb Ig类及亚类的检定 6株杂交瘤细胞的培养液经10倍浓缩后与抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM免疫血清（Sigma公司产品）作免疫双扩散试验。
1.5 6株McAb中和滴度的检定 取细胞病变90％以上时的维持液作病毒滴定，稀释成100TCID50／0.1 ml与等量不同稀释度的McAb混合，37 °C 1 h，每孔取0.2 ml接种2BS细胞单层，每个稀释度接种6个孔。观察2周计算出保护50％的细胞不发生细胞病变的血清稀释度，即中和滴度。
1.6 6株McAb的病毒特异性试验［4］ HCMV AD169、单纯疱疹病毒（HSV）-1和HSV-2感染24孔培养板孔底盖玻片上的2BS细胞（未感染病毒的2BS细胞作对照），3 d后倒去培养液，0.02 mol／L的PBS（pH7.4）洗3次，用－24 °C冰箱保存的丙酮固定10 min，洗3次，每孔加入杂交瘤细胞培养液0.5 ml。37 °C 1 h后倒去,洗3次，每孔加入抗Balb／c小鼠IgG荧光抗体（Sigma公司产品1∶20稀释）0.2ml，洗3次，取出盖玻片，在双蒸水中清洗1次，在盖玻片上加1滴1∶2稀释的甘油，反贴在载玻片上，荧光显微镜检查。
1.7 6株McAb相应抗原多肽在感染细胞内合成时相的检定 HCMV AD169感染2BS细胞后分别于2、12、24、48、60、72、84、96 h从培养板孔中取出盖玻片，荧光染色的其它步骤同前。
1.8 6株McAb相应的抗原多肽分子量的检定［3］ 将HCMV抗原多肽在SDS聚苯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上展开，将展开后的抗原多肽转移到硝酸纤维素薄膜上（NC），在NC上进行ELISA，底物改用3，3’-二氨基联苯胺四氢氯化物，在暗处显色15 min，蒸馏水终止反应。
2 结果
2.1 6株杂交瘤的染色体分析结果 6株杂交瘤的染色体的数目平均为107条。对连续传代30代再在液氮中冻存1年后的杂交瘤作染色体检查仍保持原有染色体数目。SP2／0和Balb／c小鼠的脾细胞的染色体数目分别为70条和40条。图1为8B8株的染色体。
图18B8株的染色体
Fig 1Chromosomes of clone 8B8
2.2 6株杂交瘤分泌McAb的稳定性研究 6株杂交瘤连续传代30代，再在液氮中冻存1年后，用ELISA和血凝试验检测杂交瘤分泌McAb的效价与建株初期比基本一致。
2.3 6株McAb Ig类及亚类的检定 免疫双扩散试验的结果表明：6株HCMV-McAb均为IgG1。
2.4 6株McAb中和滴度的检定 结果表明：8D6为中和抗体，效价为1∶4。
2.5 6株McAb的病毒特异性试验 结果见表1。
表1 6株HCMV-McAb的特异性反应
Tab 1 Special reactivity of 6 HCMV-McAb
| viruses infected cells | 7B4 | 7D7 | 7E7 | 7E11 | 8B8 | 8D6 |
| HCMV | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| HSV-1 | － | － | － | － | － | － |
| HSV-2 | － | － | － | － | － | － |
| normal cell | － | － | － | － | － | － |
2.6 6株McAb相应抗原多肽在感染细胞内合成时相的检定 结果见表2。8B8 McAb相应的抗原多肽位于感染细胞核内，感染后12 h即可检测到。7B4、7D7、7E7、7E11和8D6 McAb所针对的抗原多肽位于细胞浆内近核膜处，感染24 h后才可检测到。
表2 HCMV感染细胞后不同时间取材与6株McAb的免疫荧光反应
Tab 2 IIFA of 6 McAb with HCMV infected cells at various time
| HCMV
post infection（hour） |
7B4 | 7D7 | 7E7 | 7E11 | 8B8 | 8D6 |
| 2 | － | － | － | － | － | － |
| 12 | － | － | － | － | ＋ | － |
| 24 | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 36 | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 48 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 60 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 72 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 84 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 96 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
2.7 6株McAb相应的抗原多肽分子量的检定 结果见图2。McAb 7B4、7D7、7E7、7E11、8B8、8D6相应的病毒多肽分子量分别为46、150、38、51、72、65 kd。
图2HCMV——多肽免疫印迹示意图
Fig 2Immunoblot of HCMV polypeptides
M：mol，wt，markers；1：7E7-38 kd；2：8D6-65 kd；
3：7D7-150 kd；4：7B4-46 kd；5：7E11-51 kd；6：8B8-72 kd
3 讨论
融合后的子代细胞具有每个亲代细胞的大部分染色体。本文的染色体分析结果证实了这一点。SP2／0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的染色体数目分别为70条和40条，两者之和为110条，杂交瘤细胞的染色体数目为107条接近于110条。杂交瘤细胞有丧失染色体的倾向。染色体的丧失将会导致Ig合成能力的丧失。6E4、7C3和8F10 3株在传代过程中（分别在8，6，10代时）由开始的HCMV-McAb阳性转变为阴性，可能为这种原因所致。对连续传代30代再在液氮中冻存1年后的6株杂交瘤细胞作染色体检查仍保持原有染色体数目，而且能稳定地分泌HCMV-McAb。
HCMV感染敏感细胞后，病毒基因在即刻早期（0～2 h），早期（2～4 h）和晚期（＞24 h）得到表达，相应的基因产物（蛋白质）称为即刻早期抗原（IEA）即α蛋白、早期抗原（EA）即β蛋白和晚期抗原（LA）也称γ蛋白。这些细胞内病毒蛋白何时能被检测到与感染复数（MOI）有密切关系［5］。本文在MOI为1的情况下，8B8相应的病毒多肽最先被检测到，12 h即出现暗淡的核内荧光。随着时间的延长，荧光亮度增加。7B4、7D7、7E7、7E11、8D6相应的病毒多肽均在24 h以后才被检测到而且均为胞浆局部（包涵体）荧光染色。结果表明：8B8是针对HCMV早期蛋白的，其它5株HCMV-McAb均是针对HCMV晚期蛋白的。
McAb 8B8相应的病毒多肽的分子量为72 kd，该肽为即刻早期基因编码的早期蛋白［6］，HCMV感染敏感细胞后几个小时就被合成，针对早期蛋白的McAb可用作HCMV的早期诊断试剂，国外已开展了这方面的应用［7］，但国内尚未开展这方面的工作，McAb 8B8的研究成功为这项工作的开展创造了条件。
6株HCMV-McAb中，5株没有中和活性，仅1株（8D6）有低滴度的中和活性。本文认为：以感染细胞外的病毒或提取病毒的包膜成份作为免疫原可获得高滴度的具有中和活性的McAb。
McAb 7D7相应的病毒多肽分子量为150 kd。该肽是一种碱性磷酸化蛋白，在病毒体内位于衣壳和包膜之间，故也称壳皮、披膜蛋白、基质蛋白［3］。由于它与其它疱疹病毒的开放阅读框架（ORF）无任何同源性，被认为是HCMV的特异性多肽。不仅特异性高，而且免疫原性也强，能被HCMV阳性血清中IgG和IgM所识别。
McAb 8D6相应的病毒多肽分子量为65 kd。65 kd肽也是一种基质蛋白，存在于致密体里［3］，但也有人认为是核衣壳的成分或是与核衣壳紧密相连的包膜基质成分或是与66 kd的披膜蛋白有关。这种肽的分子量各家报道的不一致（64～69 kd）可能是由于电泳条件不同、试验毒株不一所致。有的研究结果表明：不论在病毒体内还是在感染细胞内，Fc受体总存在于65 kd肽上。65 kd肽是不是早期抗原有相互矛盾的报道。
McAb 7E7相应的病毒多肽分子量为38 kd。38 kd肽位于病毒体内衣壳上，故称衣壳蛋白，因有装备功能也称装备蛋白（assembly protein）［5］。38 kd肽可用于血清学诊断抗原。有文献报道：针对38和66 kd肽的IgM出现较早，针对150 kd肽的IgM出现较晚。
McAb 7E11相应的病毒多肽分子量为51 kd。51 kd肽是不是52 kd还难以确认，从分子量大小上看仅相差1 kd，可能是同一肽。对52 kd的认识尚不一致，有的认为是DNA结合蛋白［7］，有的则认为是包膜糖蛋白，52 kd肽的确切的生物学功能不很清楚，REVELLO［7］将针对52 kd肽的McAb标上酶用于捕获法ELISA中检测HCMV-SIgM受到很好的效果。
McAb 7B4相应的病毒多肽的分子量为46 kd。目前对这种肽的研究报告很少。有人报告：分子量与它接近的49 kd肽可作先天性感染诊断用的抗原。
［基金项目］ 江苏省卫生厅（H9515）；计生委科研基金（J9506）
［作者简历］ 严华（1955－），男，江苏泰兴市人，副教授，硕士，主要从事医学诊断试剂盒的研究工作。
［参考文献］
［1］ 严 华，戴 斌.HCMV-McAb的研制、检定和应用［J］.单克隆抗体通讯，1994，10（3）：27－30．
［2］ 关明旭，刘兰青，陈淑荣，等.检测抗巨细胞病毒IgM抗体的ABC-ELISA法与常规ELISA法的比较研究［J］.中国医科大学学报，1988，17（3）：182－186.
［3］ JAHN G，SCHOLL BC，TRAUPE B，et al.The two major structural phosphoproteins （pp65 and pp150） of human cytomegalovirus and their antigenic properties［J］.J Gen Virol，1987，68（5）：1 327－1 337.
［4］ LAW KM，SMITH PW，FARRAR GH.A murine McAb recognizing a single glycoprotein within a HCMV virion envelope glycoprotein complex［J］.J Med Virol，1985；17（3）：255－266.
［5］ 王 鸣，张咏南.人巨细胞病毒蛋白质［J］.国外医学微生物学分册，1988，11（5）：196－199.
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［7］ REVELLO MG，PERCIVALLE E，ZANNINO M，et al. Development and evaluation of a capture ELISA for IgM antibody to the HCMV major DNA binding protein［J］.J Virol Meth，1991，35（3）：315－329.
［收稿日期］ 1999-08-10； ［修回日期］ 2000-01-04