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【摘要】 目的 研究人类巨细胞病毒(HCMV)感染和动脉粥样硬化发生的相关性。方法 根据冠脉造影结果将患者分为冠状动脉粥样硬化组（420例）和非冠状动脉粥样硬化组（144例），收集介入治疗患者血清。ELISA检测血清标本中HCMV特异性抗体IgM和IgG以及CRP水平。采用PCR检测动脉粥样硬化斑块中的HCMV特异性基因。结果 ELISA检测结果显示：在所有血清标本中都没有检测到HCMV特异性抗体IgM，但动脉粥样硬化患者血清中检测HCMV特异性抗体IgG阳性率（242/420，57.6％）显著高于非动脉粥样硬化对照组（52/144，36.1％），统计学处理表明HCMV特异性抗体IgG和动脉粥样硬化有显著相关性（P＝0.02）。动脉粥样硬化患者血清CRP的水平较非动脉粥样硬化患者显著升高（59.122±37.945 vs 28.708±17.612，P＜0.001），HCMV特异性抗体IgG阳性患者中的CRP也显著高于阴性组（56.482±38.203 vs 43.384±33.608，P＝0.002）。PCR检测动脉粥样硬化斑块中的HCMV特异性基因，结果表明动脉粥样硬化病损部位HCMV特异性基因出现的频率（17/20，85％）显著高于正常的血管组织（2/7，28.6％）（P＝0.01）。结论 HCMV感染可导致炎症反应，并直接参与动脉粥样硬化的发生。
【关键词】 动脉粥样硬化；巨细胞病毒；C反应蛋白；炎症
Study on the relationship between atherosclerosis and infection of CMV
TANG Zong-qing，YOU Kun，WANG Xiao-qin.Department of Clinical Diagnostic Laboratory，Xinghua People’s Hospital，Jiangsu 225700，China
【Abstract】 Objective Aim to study the relationship between atherosclerosis and infection of HCMV.Methods Subjects were divided into atherosclerosis patients group (n=420) and non-atherosclerosis control group (n=144) based on the PTCA.Blood samples were collected from these subjects and then serums were prepared.CRP and HCMV-specific IgG，IgM were detected by ELISA.PCR amplification was performed for detecting the HCMV-specific gene extracted from normal control and atherosclerotic tissues.Results The HCMV-specific IgM could not be detected in all serum samples，the ratio of HCMV-specific IgG positivity (242/420，57.6％) in serums from atherosclerosis patients was significantly higher than that in non-atherosclerosis controls (52/144，36.1％)，while statistics analysis showed that there was significant association between HCMV-specific IgG and atherosclerosis (P＝0.02).Furthermore，the concentration of serum CRP of atherosclerosis patients was prominently higher than that of non-atherosclerosis controls (59.122 ± 37.945 vs 28.708 ± 17.612，P＜0.001)，and the concentration of serum CRP in HCMV IgG-positive subjects was strikingly higher than that in HCMV IgG-negative subjects (56.482±38.203 vs 43.384±33.608，P＝0.002).PCR analysis demonstrated that the existent frequency of HCMV gene in atherosclerotic lesions (17/20，85％) was higher than that in normal vascular tissue (2/7，28.6％) (P＝0.01).Conclusion Infection of HCMV leads to inflammation，and suggesting that HCMV could contribute to pathogenesis of atherosclerosis by triggering inflammation.
【Key words】 atherosclerosis；HCMV；CRP；inflammation
动脉粥样硬化是一个多种因素参与的复杂的过程，在临床上动脉粥样硬化引起的冠心病只有大约一半的病因可以用经典的危险因素来解释，如：年龄、性别、高血压、高血脂、吸烟以及糖尿病等。且针对这些原因的治疗和预防，却不能取得较大的效果，促使人们寻找新的发病原因。近年来，炎症反应在动脉粥样硬化发生中的作用已经受到极大的关注［1］。炎症细胞的浸润、炎症分子的参与以及由此促发的后续事件贯穿于动脉粥样硬化的所有过程。但触发和维持这种炎症反应的因素至今未被确定。感染和炎症的关系已经是一个古老的话题，但是否由于感染引起炎症而导致动脉粥样硬化却引起人们极大的兴趣。国外已有学者研究认为HCMV (human cytomegalovirus) 和肺炎衣原体与动脉粥样硬化之间有一定的相关性［2～4］。目前取得的研究成果主要来自流行病学、病理学，也有部分的机制研究。尽管取得了这些成绩，但由于动脉粥样硬化本身的复杂性，以及各实验室取得样本和病人背景的差异，以至于研究感染特别是某种病原体的感染和动脉粥样硬化的因果关系非常困难。
CMV属于疱疹病毒科（herpesviridae）的β亚家族，是dsDNA病毒，在人群中的感染率很高。体外研究显示，CMV可感染血管内皮细胞和平滑肌细胞，且可引起小血管的炎性浸润。动脉平滑肌细胞中CMV的即刻早期抗原IE72的表达与清道夫受体的表达升高相关［5］，IE73的表达与平滑肌细胞的增殖有关［6］。单核细胞和内皮细胞的粘附对动脉粥样硬化的发生、发展非常重要，这一过程依赖于内皮细胞表面的粘附分子的表达升高。CMV感染内皮细胞可上调细胞间粘附分子1(ICAM-1)、E选择素等粘附分子的表达，更有利于白细胞和单核细胞的粘附［7］。CMV感染大鼠虽然不能诱发动脉粥样硬化，但可引起大动脉的内皮损伤、白细胞在内膜的粘附增加以及脂质在内膜的沉积［8］。在实验性的器官移植中，CMV虽然不能感染平滑肌细胞，但可引起内膜下的感染、内皮的活化、白细胞的粘附及内膜增厚。以上这些报道提示HCMV感染引起的炎症可能与动脉粥样硬化相关联。为研究HCMV感染与动脉粥样硬化之间的关系我们通过对诊断为动脉粥样硬化的病人的临床资料的统计分析，进一步探讨CMV和动脉粥样硬化的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 HCMV特异性的IgG试剂盒以及CRP的定量ELISA试剂盒［购自Diognostic System Laboratories (DSL) 公司，Webster，TX］；离心机（Heraeus，Hanau，Germany）；-20℃冰箱（海尔，中国青岛）；-70℃冰箱（Harris制造公司，Asheville，NC，USA）；ELX800自动酶标仪（Bio-Tek仪器公司，Winooski，VA）；PCR扩增仪GeneAmp2400 （Applied Biosystem，Foster City，CA）；GeneQuant（Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ）；凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）。
1.2 临床研究对象 共有564例病人参与本研究。本研究的病人经过冠脉造影可分为冠状动脉粥样硬化组和非冠状动脉粥样硬化的对照组。只要有一支冠状动脉的主要分支有狭窄或者不光滑就归为动脉粥样硬化组。在此，纳入分析的动脉粥样硬化的危险因素包括年龄、性别、吸烟史、糖尿病、高胆固醇、高血压以及CRP水平。停止吸烟20年以上认为不吸烟；如果病人正在使用胰岛素、降糖药或者曾经接受过此类治疗认为是糖尿病；血中胆固醇高于6.2mmol/L或者正接受降脂治疗认为是高胆固醇；血压高于140/90mmHg或者正服用降压药物者视为高血压。
1.3 血清的分离和保存 采集血样收集于经灭菌的离心管中（不加柠檬酸盐或肝素），于室温放置使之凝固，吸取上清分装后保存于-70℃，备用检测抗体和血清中CRP。
1.4 CMV特异性抗体IgG的检测 ELISA法用于检测血清中HCMV特异性的抗体IgG。具体步骤按试剂盒说明书进行。TMB显色源显色，以620nm为背景波长，测定450nm的OD值。若样本的OD450和临界值的OD450之比＞1.1即认为阳性。
1.5 CRP的定量测定 ELISA法用于检测血清中CRP 的浓度，具体方法按试剂盒说明书进行。分别以样品标准的OD450和CRP浓度（ng/ml）的对数值为纵轴和横轴进行直线回归，计算各标本的CRP浓度。
1.6 基因组DNA的提取 按文献进行［9］。将组织块剪碎并置于液氮中冻结后捣碎，消化缓冲液悬浮。在50℃振荡下温育过夜，用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提样品，3000rpm 离心10min，上清转移至一新管中，加入1/2 体积的7.5mol/L 乙酸铵和2 体积的无水乙醇，3000rpm 离心2min。70％的乙醇洗涤后，沉淀用TE 缓冲液溶解，GeneQuant 测定DNA 的浓度。
1.7 动脉粥样硬化斑块组织中CMV的检测 病人手术中取得的冠状动脉血管组织共27 例，其中有动脉粥样硬化病变的有20 例，另外7 例无动脉粥样硬化。从血管组织中提取高分子量的DNA 用于PCR 扩增检测CMV 特异性的基因。一对用于扩增即时早期（IE）基因的引物被设计用于扩增出一234-bp 的片段。引物序列如下：上游引物，5’-GCCAT TAGCC GTATC TAGCA-3’；下游引物，5’-ATGCGCTGTG ATGCG GGTAT-3’。引物采用DNAStar 5.0 自行设计，Blast 数据库检索无其他非特异性配对，皓嘉公司合成。首先，95℃ 5min，接着扩增35个循环，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃延伸10 min。PCR 产物于2％的琼脂糖凝胶上电泳，采用凝胶图像处理系统拍照分析。
1.8 统计学分析 所有的分析均使用SPSS软件包。分类资料分析采用χ2检验。所有检验均为双侧。血清CRP水平、HCMV特异性抗体以及动脉粥样硬化之间的统计均采用偏相关分析。
2 结果
2.1 临床资料统计分析 564例病人被纳入本研究。病人的年龄范围从29～88岁，平均为62.1岁。其中男397例，占研究总数的70.4%，女267例，占29.6％。其中420例为冠状动脉粥样硬化，144例为非冠状动脉粥样硬化。除了吸烟外，其他各项危险因素（年龄、性别、高脂血症、糖尿病和高血压）都和动脉粥样硬化相关（表1）。表1 动脉粥样硬化与常见危险因素相关性分析注：* Partial correlation analysis，** Data are means±SD
2.2 HCMV感染和动脉粥样硬化的关系 首先检测HCMV在调查病例中的阳性率发现：在420例动脉粥样硬化病人中，242例（57.6%）病人HCMV IgG阳性；而在144例非动脉粥样硬化病人中，HCMV IgG 阳性率仅为36.1%（52/144）。应用统计分析发现动脉粥样硬化在HCMV阳性的人群中的发病率显著高于HCMV阴性的人群（表2）。在所有HCMV IgG阳性的病人中，动脉粥样硬化的发病率达82.3%（242/294），而在HCMV IgG阴性的病人中，动脉粥样硬化的发病率只有65.9％（178/270）。并进一步作HCMV感染和动脉粥样硬化的经典危险因素之间的关系分析。利用偏相关分析，平衡6种常见的动脉粥样硬化危险因素(年龄、性别、吸烟、糖尿病、高血脂以及高血压)后，动脉粥样硬化和HCMV IgG的阳性率显著相关(P＝0.02) （表3）。从另一方面来看，我们的统计结果表明HCMV的感染和年龄、性别、糖尿病、高血压以及高血脂没有显著的相表2 抗HCMV抗体IgG水平和动脉粥样硬化的关系表3 HCMV感染和动脉粥样硬化常注：*partial correlation analysis，**Data are mean±SD
2.3 CRP的水平和动脉粥样硬化以及HCMV感染的关系 CRP是近年来用来评估动脉粥样硬化的一个极敏感的危险因素指标，同时也是一个炎症发生的很重要的预示指标，为进一步探讨HCMV与动脉粥样硬化的关系，首先比较CRP在动脉粥样硬化和非动脉粥硬化病人中差异发现：动脉粥样硬化病人的血清CRP水平较无动脉粥样硬化的病人显著升高（59.122±37.945 vs 28.708±17.612）（图1）；而且HCMV感染阳性的病人血清中的CRP的水平也较无HCMV感染的病人显著升高（56.482±38.203 vs 43.384±33.608，P＝0.002）（图2）。
图1 CRP含量和动脉粥样硬化的关系2.4 动脉粥样硬化斑块组织中HCMV基因的检测 共有20例冠状动脉粥样硬化的组织标本，正常的血管组织标本7例。血管组织中提取的高分子量的DNA，PCR扩增检测HCMV特应性基因(图3)。在20例冠状动脉粥样硬化的组织标本中，有17例标本可检测到HCMV特异性基因；而在7例正常的血管组织中，只有2例可检测到HCMV特异性基因。统计学分析二者有显著相关性（P＝0.01）（表4）。图2 CRP含量和HCMV感染之间的关系
3 讨论
我们的研究建立在一个较大样本的基础上，且临床病例资料都经过严格的核实和整理，详细齐全。冠脉造影是临床常用的诊断冠心病（CAD）的手段，研究中的所有病人均经过冠脉造影证实。CAD 曾经一度被认为是“富裕病”，现已逐渐成为了全球性的疾病，给社会造成了极大的负担。作为CAD 的最常见病因，动脉粥样硬化已成为当今的研究热点。本部分通过一个较大样本的血清学资料在临床流行病学水平研究动脉粥样硬化和HCMV 感染的关系，结果表明抗HCMV抗体IgG 和动脉粥样硬化以及血清CRP 水平都独立相关。由于血清CRP 水平的升高反映了慢性持续性的炎症反应状态并和心血管疾病的发生率密切相关［10］，而炎症反应现已成为公认的动脉粥样硬化发病的重要机制［11］。因此我们的研究结果提示了HCMV 感染和动脉粥样硬化发病中的因果关系。虽然HCMV 感染和CRP 水平是独立相关的，但其他多种因素也可能导致血清CRP 水平的升高。我们在此采用了偏相关分析，在平衡了CRP 水平以及多种经典的心血管危险因素之后，结果仍然显示HCMV 感染和动脉粥样硬化是相关的。我们的研究结果虽然提示HCMV 的感染通过引起慢性炎症反应参与CAD的发生，但HCMV 引发的自身免疫也可能是重要的机制。鉴于多种病原体单独或者共同参与动脉粥样硬化的发生，而它们的生物学性状和导致的症状各不相同，因此它们可能通过一个共同的途径，即通过诱导炎症反应和免疫应答参与动脉粥样硬化的发生。已经有假说提出关于动脉粥样硬化发生的自身免疫学说［12］。这种横断面研究（cross-section）虽然可建立相关性，但并不能确立事物之间的因果关系。这种研究与其用于证明假说，不如用于建立初步的假说。其次，在我们的研究中，非动脉粥样硬化的对照组只是冠状动脉部位没有动脉粥样硬化，实际上不能真正代表那些完全没有动脉粥样硬化的人群。第三，这种情况的发生可能只是因为发生动脉粥样硬化的个体更容易感染HCMV。第四，由于血清中IgG水平的升高是系统免疫应答的结果，并不是器官特异性的，也可能是其他器官感染HCMV 的结果。由于血清流行病学研究不能反映组织特异性，病原体在病变局部的存在将为其参与疾病发生发展提供直接的证据。因此，为寻找HCMV可能参与动脉粥样硬化的发生发展的直接证据，我们又进一步探讨了HCMV是否存在于动脉粥样硬化斑块组织中。本研究通过PCR检测病变组织中的HCMV特异性基因来确定HCMV是否为组织特异性的。结果表明HCMV基因可在85.0％的动脉粥样硬化斑块组织中检测到，而在正常的血管组织中只有28.6％，显著低于动脉粥样硬化斑块中的检出率。
针对以上研究，仍然存在一些问题。比如，在动脉粥样硬化损伤部位出现的病原体也许只是“局外人”（innocent bystander），并非表明二者具有因果关系。而且另外一种解释还可以是发生动脉粥样硬化的血管更易于被感染。仅仅靠上面的研究无法回答这些问题，因此我们有必要更进一步探讨可能参与的机制。
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作者单位： 225700 江苏兴化，兴化市人民医院检验科
(编辑：宋 冰)