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对IL-4两种测活方法的比较及MTT法最适条件确定
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 技术与方法
作者：唱韶红 熊凌霜
单位：唱韶红（军事医学科学院生物工程研究所， 北京 100071）；熊凌霜（军事医学科学院生物工程研究所， 北京 100071）
关键词：IL-4；CTLL-2／IL-4R细胞系；MTT
［摘 要］ 目的 建立一种稳定、灵敏的方法用于检测IL-4生物活性。方法 比较人外周血T淋巴细胞与CTLL-2／IL-4R细胞系对rhIL-4的增殖应答特点及MTT法用于rhIL-4生物活性检测过程中的细胞浓度、细胞培养时间、MTT掺入浓度及时间等条件。结果 两者均能对rhIL-4呈规律性增殖应答。IL-4活性测定时，人外周血T淋巴细胞检测最低限为8 U／ml，CTLL-2／IL-4R细胞系为0.73 U／ml。确定了MTT法用于CTLL-2／IL-4R细胞系检测rhIL-4生物活性时的最佳条件方案。结论 就重复性和应答敏感性来说，CTLL-2／IL-4R较之T淋巴细胞更为优越，该细胞系可用于建立一种较灵敏而稳定的IL-4测活方法。
［中图分类号］ R392-33 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0300-04
Comparison of two assays for the determination of the biological acti-vity of rhIL-4 and establishment of the optimal procedure for MTT assay
CHANG Shao-hong，XIONG Ling-shuang
（Insititute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China）
［Abstract］ Objective To establish a stable and sensitive assay for the determination of the biological activity of rhIL-4.Methods The characteristic of proliferation response of human peripheral blood T lymphocyte and CTLL-2／IL-4R cell line on rhIL-4 was compared．At same time，some conditions involved in the MTT assay was also compared，such as cell number，culture time，MTT concentration and incubation time，etc．Results The two assays all presented regular response．The lowest detectable biological activity of rhIL-4 determined by human peripheral blood T lymphocyte and CTLL-2／IL-4R cell line was 8 U／ml and 0.73 U／ml respectively．The optimal procedure for MTT assay was also established． Conclusion CTLL-2／IL-4R cell line was found to be superior to T lymphocyte on stability and sensitivity．
［Key Words］ IL-4；CTLL-2／IL-4R cell line；MTT
人白细胞介素4（hIL-4）是由活化的TH2淋巴细胞分泌产生的细胞因子。它具有多种生物学活性，可以刺激活化的B和T细胞的增殖，强化B细胞的抗原提呈能力，并能调节造血干细胞的增殖及分化。它在抗肿瘤免疫治疗方面具有很大潜力。目前，国外正进行Ⅱ期临床试验。在hIL-4的研究中，其生物活性的准确测定非常重要。由于IL-4对人体多种细胞均具效应，因此可以采用多种细胞材料显示其活性。本文选取用人外周血淋巴细胞经典测活法［1，2］与CTLL-2／IL-4R细胞系检测rhIL-4活性法［4］进行比较，摸索准确反映rhIL-4活性的实验方法。为保证测定结果的准确，我们又比较了采用CTLL-2／IL-4R细胞株通过MTT比色法［3］测定rhIL-4活性的各种条件，以确定使用这种方法对rhIL-4活性测定时的最佳条件。
1 材料和方法
1．1 主要试剂 重组人IL-4（GIBCO）；植物血球凝集素（PHA）（广州医药研究所制）；淋巴细胞分层液（军事医学科学院制）；MTT溶液（进口分装），溶解于0.01 mol／L，pH7．4的PBS中，过滤除菌后，置棕色瓶，4 °C保存；细胞培养基RPMI-1640（GIBCO）。
1．2 细胞
1．2.1 CTLL-2／IL-4R细胞：由北京医科大学提供，该细胞有IL-4受体，对IL-4有明显的应答反应。
1．2.2 T淋巴细胞：从正常成年人外周血肝素钠抗凝分离获得。
1．3 方法
1．3.1 外周血T淋巴细胞测rhIL-4活性：参考文献［7］中的淋巴细胞分离方法，抽取正常成年人外周血肝素钠抗凝，经淋巴细胞分层液离心后取单个核细胞层，通过对离心速度、血液稀释倍数以及PHA浓度的改进，使每毫升血T淋巴细胞的获得量为1×106个。调整细胞浓度到5×105／ml，加PHA使终浓度为10 μg／ml，活化72 h后收集细胞，得到母细胞化的T淋巴细胞。在96孔板上分别将rhIL-4标准品和待测样品做倍比稀释，加入活化的T细胞，5×104／孔，37 °C，5％ CO2培养72 h左右，掺入MTT溶液20 μl／孔，5 h后加入20％ SDS／0.01 N HCl终止，放置过夜后，测OD570值。
1．3.2 CTLL-2／IL-4R细胞系检测rhIL-4活性：收集对数生长期的CTLL-2／IL-4R细胞，用培养基洗3遍。在96孔板上倍比稀释rhIL-4标准品和样品，加入细胞3×104／孔。37 °C，5％ CO2培养箱培养40～44 h，待阴性孔细胞90％死亡时，加入MTT溶液20 μl／孔，5 h后加入终止液，放过夜后，测OD570值。
1．3.3 MTT测定：对数生长期细胞按一定浓度接种50 μl到96孔板（costar），设3个重复孔，空白为不含细胞的完全培养基，阴性对照为不含IL-4的空白培养基及细胞。加入数种实验浓度的MTT于孔中，置37 °C，5％ CO2于培养箱中继续培养从1～6 h的不同时间。然后每孔加入溶解液，放置过夜，使沉淀完全溶解。用全自动酶标仪（BIO-RED Model 450）测定其OD570值。
2 结果
2.1 人外周血T淋巴细胞与CTLL-2／IL-4R细胞系对IL-4活性应答的比较
2.1．1 对标准rhIL-4应答曲线的比较：从图1看出：T淋巴细胞和CTLL-2／IL-4R细胞系均可对IL-4产生增殖应答反应。但是T淋巴细胞的应答曲线OD值较低，而且曲线走势平缓，而CTLL-2／IL-4R与rhIL-4的应答曲线随着rhIL-4的稀释下降趋势明显。并且T淋巴细胞的阴性对照OD570为0.106，CTLL-2／IL-4R细胞阴性对照OD570为0.021。经计算，前者的检测最低限为8 U／ml，而后者的检测最低限为0.73 U／ml。
图1人外周血T淋巴细胞和CTLL-2／IL-4R细胞与rhIL-4应答标准曲线
Fig 1The dose-response curve of T cell and CTLL-2／IL-4R cell on rhIL-4 standard
2.1.2 测定值重复性的比较：从3名成年人的外周血中分离T淋巴细胞，分别测定同一样品。同时将不同传代次数的CTLL-2／IL-4R细胞也对同一样品进行测定，结果见表1。
表1 T淋巴细胞和CTLL-2／IL-4R细胞检测样品重复性的比较
Tab 1 Comparison of the duplicity of the samples determined by T cell and CTLL-2／IL-4R
| batch | T cell
special activity |
CTLL-2／IL-4R
special activity |
| 1 | 1．63×106 | 3.79×106 |
| 2 | 7．73×106 | 3.28×106 |
| 3 | 5．32×106 | 2．45×106 |
| CV（％） | 36．9 | 9．27 |
P＜0.05（μ-test） 由表1结果可以看出：用人外周血T淋巴细胞测rhIL-4活性时，样品测定值的差异较大，其批次间的变异系数（CV）值也较大。而CTLL-2／IL-4R细胞系所测定的样品，其批次间的变异系数（CV）值较小。
2.2 MTT法用于rhIL-4活性测定的最佳条件确定 用CTLL-2／IL-4R细胞测定rhIL-4活性时，用MTT掺入法，通过测定OD570 nm的吸收值，来计算待测样品的活性值。MTT法是MOSMANN［3］创立的一种简便、快速的比色方法，其后TADA［5］和GREEN［6］等人又对该方法进行了改进。由于每种细胞株各具不同的生物特性，针对CTLL-2／IL-4R细胞系，比较了培养时间、细胞浓度、MTT浓度及MTT保留时间等几个重要的实验条件，最后确定了最佳方案，使实验结果更为准确。
2.2.1 CTLL-2／IL-4R细胞的培养时间：在培养板中将IL-4做倍比稀释，取对数生长期的CTLL-2／IL-4R细胞，每孔加入3×104细胞，分别培养24、48、72、96 h，结果见图2A。在此基础上，我们又分别比较了细胞培养40、44、48、52 h的生长状况，结果见图2B。
图2CTLL-2／IL-4R细胞不同培养时间
Fig 2Period of culturing CTLL-2／IL-4R cells with
IL-4
由图2A可看出：细胞在48 h时生长状况较好，生长曲线的走势也较好。
由图2B可见：细胞培养从40 h开始达到了一个高值，在44、48 h也均显高值，生长曲线走势较好。若继续培养，在52 h的时候OD值已明显下降。
2.2.2 CTLL-2／IL-4R细胞浓度：在培养板中将rhIL-4做倍比稀释，分别加入不同数量的细胞，每孔1万～4万。结果见图3。
图3不同细胞浓度与OD值的关系
Fig 3Effect of the initial number of CTLL-2／IL-4R cells
（◇ ▲●×104）on the dose-response curve of IL-4
由图3可知：随着细胞数量的增加，OD值也在增加，其中3万～4万时的细胞生长曲线走势较好。由于仪器敏感度的影响，一般将最大吸收值控制在1．2以下，所以最后确定细胞浓度为3万／孔。
2.2.3 MTT的浓度：为确定最大显示值，我们比较了MTT浓度与OD值的关系。在种有同样数量细胞的培养板中，每孔分别加入20 μl MTT浓度为0～10 mg／ml，并在其中一块板上添加了IL-4因子，以观察IL-4因子是否会对OD值产生影响。结果见图4。
图4MTT浓度与OD值的关系
Fig 4Effect of the concentration of the MTT solution on the amount of MTT formazan produced
由图4可知：添加IL-4的细胞OD值随着MTT浓度的增加而升高，当升至5 mg／ml时则出现平台期，而大于8 mg／ml时则略有下降。不加IL-4因子的细胞，OD值无明显变化。
2.2.4 MTT的保留时间：分别将起始孔含有200 U、50 U rhIL-4因子以及不加rhIL-4因子的细胞培养40 h后，加入20 μl MTT浓度为5 mg／ml，分别在1、2、3、4、5、6 h加入终止液，待沉淀完全溶解后测吸收值，结果见图5。
图5不同MTT保留时间与OD值的关系
Fig 5Effect of the incubation period with MTT on the amount of MTT of formazan produced
由图5可知：在1～4 h内随着MTT保留时间的延长，吸收值升高较快，均在4～6 h进入平台期，而与IL-4因子的浓度无关。
3 讨论
本实验比较了人外周血T淋巴细胞与CTLL-2／IL-4R细胞系对rhIL-4应答的敏感性和稳定性。结果表明：二者对rhIL-4均有增殖应答反应，而CTLL-2／IL-4R细胞系较之T淋巴细胞对rhIL-4应答敏感性更高。T淋巴细胞用于IL-4活性测定时，由于血源不同，个体差异较大，使测定值间的差异也较大。而用CTLL-2／IL-4R细胞系测rhIL-4活性时，不存在个体差异的问题，测定样品值的重复性较好，同时又避免了血液污染及血源困难等问题，操作简单，省时省力，可以作为一种稳定而灵敏的IL-4活性测定方法，更有利于科研和临床应用。
通过实验，确定了使用MTT比色法测定rhIL-4活性时的最佳条件。选择CTLL-2／IL-4R细胞株培养40～44 h，细胞浓度为3万／孔，MTT掺入浓度为5 mg／ml，MTT保留时间为4～6 h。
［作者简介］ 唱韶红（1971－），女，黑龙江太康县人，助理实验师，大专，主要从事生物工程下游技术的研究。
［参考文献］
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［4］ HU-LI J，OHARA J，WATSON C，et al．Derivation of a T cell line that is highly responsive to IL-4 and IL-2（CT4R）and of an IL-2 hyporesponsive mutant of that line（CT4S）［J］．Immunol，1989，142（3）：800－807．
［5］ TADA H，SHIHO O，KUROSHIMA K，et al．An improved colorimetric assay for interleukin 2［J］．Immunol Methods，1986，93（2）：157－165．
［6］ GREEN LM，READE JL，WARE CF，et al．Rapid colo-rimetric assay for cell viability application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lymphokines［J］．Immunol Methods，1984，70（2）：257－268．
［7］ 巴德年．当代免疫学技术与应用［M］．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.156－158．
［收稿日期］ 1999-08-23； ［修回日期］ 2000-04-14