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一、资料和方法
本工作以30份全血及15份淋巴细胞为研究标本。(1)全血标本为新鲜或冻存的乙二胺四乙酸(EDTA)或酸-枸橼酸-葡萄糖(ACD)抗凝血3 ml。(2)淋巴细胞为HLA-A、B抗原血清学分型或淋巴细胞毒交叉试验中剩余的淋巴细胞。DNA提取方法有3种：
1.标准酚-氯仿提取法：按常规方法进行(具体步骤略)。
2.NP-40法：根据John等报道的NP-40法，进行部分改进。其步骤简述如下：取EDTA抗凝血0.5 ml，加0.5 ml溶液Ⅰ(10 mmol/L Tris-盐酸，10 mmol/L氯化钾，10 mmol/L 氯化镁)，加入16 μl NP-40混匀；3 000×g低速离心10分钟，去上清液，加80 μl溶液Ⅱ(10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L氯化钾，10 mmol/L氯化镁，0.5 mol/L氯化钠，0.5%SDS，2 mmol/L EDTA)悬浮沉淀；以下进行酚-氯仿抽提(步骤同标准酚-氯仿抽提法)。
3.辛酸法：在Planelles等的方法进行部分改进：取EDTA或ACD抗凝血1 ml，加Triton X-100 20 μl，翻转混匀4～5次，13 000×g离心10秒；去上清，加500 μl三蒸水、500 μl磷酸盐缓冲液、100 μl 2%脱氧胆酸钠混匀，13 000×g离心30秒；去上清，沉淀加2mol/L NaCl 1 ml，10%SDS 50 μl，辛酸(预稀释成工作浓度，无水乙醇：辛酸=5∶1)50 μl震荡1分钟，13 000×g离心1分钟；取下层水相加1 ml无水乙醇沉淀DNA，以70%乙醇洗2次，以三蒸水100 μl溶解DNA(60℃助溶5分钟即可使用)。
统计学处理，多组间均数的比较用方差分析。
二、结果
1.DNA的含量及纯度测定：30份EDTA或ACD抗凝血标本分别采用以上3种方法进行DNA抽提，以岛津UV-240紫外光法测定DNA的含量及260 nm/280 nm的吸光度(A)值比率，DNA的量按1 ml全血所提取的DNA量计算(附表)。
附表 3种PCR模板制备方法的DNA含量、纯度、扩增效果
及所需时间的比较(x±s)
| 方 法 | DNA含量(μg) | A260/280nm | 时间(min) |
| 标准酚-氯仿 | 18.5±4.1 | 2.01±0.30 |
840 |
| NP-40 | 17.2±3.2 | 1.98±0.19 | 60 |
| 辛酸 | 18.7±4.1 | 2.02±0.30 | 20 |
| 三组间均数比较P值 | ＞0.05 | ＞0.05 |
2.提取DNA的琼脂糖凝胶电泳结果：3种方法所提取的DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，所提DNA带型整齐，提示DNA均无明显降解。
3.HLA基因分型效果：采用PCR-SSP法对3种方法制备的30份DNA标本进行HLA-DR基因分型，3种方法均很稳定，扩增成功率100%(附表)，同一标本中不同方法提取DNA的基因分型结果一致；另外分别采用NP-40和辛酸法对15份淋巴细胞标本进行DNA抽提也均获成功，扩增效果满意，HLA基因分型结果与其全血标本完全一致。
4.3种DNA制备方法所需时间见附表。
三、讨论
HLA基因分型技术目前已广泛应用于临床器官移植，但由于模板DNA的制备耗时太长，使之难以完全满足临床的需要。标准的酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一，但该法耗时长，影响了临床应用。我们探索了几种抗凝血标本DNA模板的快速制备方法，发现煮沸法虽快捷(30分钟)，但结果不稳定，重复率不高；NP-40法和辛酸法则是理想的血液DNA模板快速制备的方法，所需时间分别为60分钟和20分钟，操作简单，所需试剂方便易得，结果稳定。通过对30份血标本DNA的提取，并与酚-氯仿法同步对比研究，所提取DNA的量和纯度与标准酚-氯仿抽提法相比无明显差异，DNA分子完整，无明显降解。3种方法提取DNA的HLA-DR基因分型结果一致。对分离出的淋巴细胞标本DNA的提取也同样获得满意结果。
尽管辛酸法较NP-40法更为快捷，但对冻存较久(1个月以上)的全血标本不如NP-40法稳定。因此，对新鲜血或淋巴细胞标本，我们多采用辛酸法，两者各有其特点，在临床检测中可结合使用。
本研究显示辛酸法和NP-40法可满足临床快速HLA基因分型的需要，不仅如此，本方法对所有血液DNA分子生物学的科研及临床检测项目均具有很广泛的应用价值。