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Reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adult Zhu Lihua, Wang Jianzhong, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing, 100034
【Abstruct】 Objective To establish the reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adults.Method Staining whole blood with fluorescein-conjugated monoclonal antibodies supplied by simultest TM IMK lymphocyte kit, we analyzed 102 healthy Chinese residents (age range 18～65 years) by FACSort flow cytometer, acquired results by Simultest programme, and performed statistical analysis by SPSS software.Results The 95% reference ranges in absolute counts per microliter of whole blood (percentage of lymphocytes) for CD+3, CD+3CD+4, CD+3CD+8, CD-3CD+19, CD-3/CD+16 and/or CD+56 cells were 955 to 2 860 (50% to 84%), 550 to 1 440 (27% to 51%), 320 to 1250 (15% to 44%), 90 to 560 (5% to 18%), 150 to 1 100 (7% to 40%) respectively. The CD+3CD+4/CD+3CD+8 ratio was 0.71 to 2.87. CD+3CD+4 cells increased and CD+3CD+8 cells decreased slightly with age. Women were compared to men in old age group, NK cells (CD-3/CD+16 and/or CD+56) were lower (P＜0.05). Compared with Caucasians and Americans, Chinese had higher percentage and absolute numbers of CD+3CD+8 and NK cells, but had lower percentage of CD-3CD+19 and CD+3CD+4 cells without absolute number change. So CD+3CD+4/CD+3CD+8 ratio skew to the lower values.Conclusion The race, age and environment could influence the reference value of lymphocyte immunophenotype.
【Key words】 Lymphocyte immunophenotype Reference value Flow cytometry
淋巴细胞免疫表型分析在原发或获得性免疫缺陷病、自身免疫性疾病的辅助诊断和移植免疫的监测中具有重要作用。随着流式细胞仪的广泛应用，采用流式细胞术进行淋巴细胞免疫表型分析已逐渐成为临床检验的常规工作之一。各国的流式细胞术实验室均建立了自己的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨。目前我国还没有用流式细胞术、采用双染色分析淋巴细胞免疫表型参考值的报告。为此我们对102例健康成人进行了淋巴细胞免疫表型分析，现报告如下。
材料和方法
一、研究对象
102例标本均取自于无免疫性疾病、无现症、不吸烟、体检健康、血细胞计数及肝、肾功能检查正常的成人。年龄18～65岁，其中男性54人，女性48人。首先按男女性别分为两大组，每组中又以40岁为界，≤40岁者为小年龄组（男24人，女19人），＞40岁者为大年龄组（男30人，女29人）。
二、 实验方法
静脉取血2～3 ml，以15 IU/ml肝素抗凝，立即送检。抗凝血在0.5～1小时内以CA570型血细胞计数仪进行白细胞计数与分类。在6小时内行荧光抗体染色。所用荧光抗体为Simultest IMK-Lymphocyte试剂盒（美国Becton Dickinson产品）。每份标本同时做6管，即IgG1/IgG2a， CD45/CD14，CD3/CD19，CD3/CD4，CD3/CD8，CD3/CD16、CD56。分别加入相应荧光抗体试剂20 μl和100 μl混匀的抗凝血于各试管底部，彻底混合后置室温暗处孵育30分钟，然后加入1×溶血液（FACS溶解液）2 ml迅速于混旋器上混匀，再置室温暗处孵育10分钟后，300×g离心5分钟。吸去上清，留下50 μl的残液，以免沉淀中细胞丢失。于混旋器彻底混匀沉淀物后，加入PBS2 ml洗涤，并以200×g离心沉淀5分钟。吸去上清，混匀细胞后加入0.5 ml 1%多聚甲醛，彻底混匀后置2～8℃冰箱中待检。
流式细胞分析一般在染色后24～48小时内进行，采用FACSort流式细胞仪（Becton Dickinson公司产），以Calibrite TM荧光微球校正光电倍增管（PMT）电压，建立荧光补偿，检查仪器灵敏度，使流式细胞仪处于最佳工作状态，然后用Simulset软件按顺序测定6管的光散射及荧光信号并同时分析结果。
三、统计学分析
全部数据输入电脑，采用SPSS软件包进行统计分析。
结果
首先分两个年龄组，在组内进行男女性别间的比较。结果显示，除大年龄组男、女NK细胞的百分率及绝对值有显著性差异外（P＜0.05），其他各项指标的组间差异均无统计学意义（P＞0.185～0.866）。进一步观察大年龄组男、女NK细胞计数的频数分布图，发现女性的NK细胞计数值（绝对值均数413/μl，相对值均数17.5%）略低于男性（绝对值均数599/μl，相对值均数23.3%），但分布基本落在男性的频数范围内，固将二者仍合并统计。
将性别合并后再次进行大、小年龄组的比较，所有指标的组间差异均无统计学意义（P＞0.156～1.000）。最后将大、小年龄组合并统计，结果见表1。
以百分位数法获得中国人淋巴细胞表型95%参考值范围见表2。
表1 102例中国健康成人淋巴细胞表型分析统计学参数
| 项目 | 均数 | 标准差 | 中位数 | 最小值 | 最大值 |
| 白细胞(个/μl) | 7 250 | 141 | 7 100 | 4 400 | 10 500 |
| 淋巴细胞 | |||||
| 相对值(%) | 34.4 | 5.42 | 35.0 | 20.0 | 43.0 |
| 绝对数(个/μl) | 2 479 | 594 | 2 484 | 1 488 | 4 483 |
| CD+3细胞 | |||||
| 相对值(%) | 68.0 | 9.65 | 68.0 | 43.0 | 85.0 |
| 绝对数(个/μl) | 1 686 | 490 | 1 593 | 948 | 3 138 |
| CD-3，CD+19细胞 | |||||
| 相对值(%) | 10.0 | 3.90 | 10.0 | 3.0 | 21.0 |
| 绝对数(个/μl) | 261 | 132 | 243 | 63 | 897 |
| CD+3，CD+4细胞 | |||||
| 相对值(%) | 38.0 | 6.73 | 39.0 | 23.0 | 55.0 |
| 绝对数(个/μl) | 972 | 341 | 939 | 521 | 2 877 |
| CD+3，CD+8细胞 | |||||
| 相对值(%) | 28.0 | 8.30 | 27.0 | 13.0 | 53.0 |
| 绝对数(个/μl) | 699 | 282 | 635 | 253 | 1 605 |
| CD-3，CD+16和/或CD+56细胞 | |||||
| 相对值(%) | 20.0 | 9.60 | 19.0 | 2.0 | 46.0 |
| 绝对数(个/μl) | 498 | 272 | 410 | 35 | 1 433 |
| CD+3，CD+4/CD+3，CD+8 | 1.51 | 0.55 | 1.44 | 0.43 | 3.00 |
表2 中国人淋巴细胞表型参考值
| 项目 | 相对值
(%) |
绝对数
(个/μl) |
| T+B+NK | 95～105 | 1 530～3 700 |
| 总T细胞(CD+3) | 50～84 | 955～2 860 |
| 总B细胞(CD-3，CD+19) | 5～18 | 90～560 |
| 辅助/诱导T细胞(CD+3，CD+4) | 27～51 | 550～1 440 |
| 抑制/细胞毒T细胞(CD+3，CD+8) | 15～44 | 320～1 250 |
| NK细胞
(CD-3，CD+16和/或CD+56) |
7～40 | 150～1 100 |
| 辅助/抑制T细胞比值
(CD+3，CD+4/CD+3，CD+8) |
0.71～2.78 | 0.64～2.85 |
讨论
由于淋巴细胞免疫表型参考值受到生态环境、社会经济因素如种族、性别、年龄、精神状态、吸烟与否、每日变异等影响，故不同的地域和种族应建立自己的参考值。本研究建立了中国人淋巴细胞免疫表型参考值。在人群免疫表型的分布上可见到CD3、CD4、CD8基本呈正态分布，而CD19、CD16和CD56，CD4/CD8比值呈偏态分布，且峰值向低值方向漂移。这与某些作者的报告是一致的［1，2］。我们以百分位数法，采用国际临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的95%可信区间确定参考值。
关于淋巴细胞表型分析的种族差异，已受到许多作者的关注。为进一步明确大陆华人的淋巴细胞表型分布特点，现将BD公司试剂盒提供的参考值、
表3 不同种族血液淋巴细胞表型分布情况
| 表型 | BD试剂盒 | 本室 | Kam | Websteret | Tollerud | Reichert |
| 相对值(%) | ||||||
| CD+3 | 59～85 | 50～84 | 54.8～83 | 男46.2～78.9
女57.8～82.7 |
48.3～85.3 | 61～85 |
| CD+3CD+4 | 男29～57
女31～61 |
27～51 | 23.1～51.0 | 24.1～50.7 | 29.4～63.3 | 28～58 |
| CD+3CD+8 | 11 ～38 | 15～44 | 17.9～47.5 | 男17.1～42.7
女19.5～44.6 |
19.4～38.4 | 19～48 |
| CD-3CD+16
和/或CD+56 |
5.6～31 | 7～40 | 7.1～38 | 男3.9～38.5
女6.4～31.1 |
仅CD16
0.5～24.1 |
6～29 |
| CD-3CD+19 | 6.4～23 | 5～18 | 5.1～20.8 | 7.7～25.4 | 4～19.3 | 7～23 |
| CD+3CD+4/
CD+3，CD+8比值 |
0.9～3.6 | 0.71～2.87 | 0.6～2.5 | 0.65～2.49 | 0.83～3.04 | 0.6～2.8 |
| 绝对数(个/μl) | ||||||
| CD+3 | 720～2 330 | 955～2 860 | 672～2 368 | 450～2 433 | - | |
| CD+3CD+4 | 男430～1 010
女500～1 760 |
550～1 440 | 292～1 366 | 410～1 404 | 294～1 590 | - |
| CD+3CD+8 | 170～1 050 | 320～1 250 | 240～1 028 | - | 222～914 | - |
| CD-3/CD+16CD+56 | 100～430 | 150～1 100 | 130～938 | - | 仅CD16
10～507 |
- |
| CD-3CD+19 | 100～430 | 90～560 | 82～560 | - | 58～456 | - |
表中各作者报告例数分别为：BD试剂盒n=160，本室n=102，Kam n=208，Websteret n=216，Tollerud n=266，Reichert n=261本室研究结果、Kam等［3］对香港华人、Webster等［4］对泰国人、Tollerud等［5］对美国人的研究以及Reichert等［6］对北欧高加索人的研究结果比较见表3。
Tollerud的研究曾发现，美国黑人与白人的白细胞绝对数有明显差别，其根本原因是由于黑人的粒细胞绝对数较低。实际上二者的淋巴细胞绝对数是没有差别的（ 白人绝对数均值2 060/μl，百分率均值为29%；黑人绝对数均值2 100/μl，百分率均值为34%)。在淋巴细胞免疫表型分析时可将二者合并分析。我国人的白细胞绝对数与美国人的无明显差异（我国均值7 252/μl，美国均值7 290/μl）但淋巴细胞的百分率与绝对数（绝对数均值2 480/μl，百分率均值为34.4%）均高于美国黑人与白人，因此造成了我国人在淋巴细胞表型分析上的一些特点。由表3可见，虽然我国人有较低的B细胞百分率，但B细胞的绝对数并不低。这与Choong等报告的华人B细胞百分率低于马来人和印度人有类似之处［2］。
T细胞亚群的变化随年龄、性别与种族而有所改变是众多研究都已涉及到的问题。由表3可见，中国人的CD+3CD+4细胞虽然绝对数不低于其它人种，但百分率向低值漂移，CD+3CD+8细胞无论百分率和绝对均较高，故而使CD+3CD+4/CD+3CD+8比值也略向低值移动。多数文章注意到男女性别在表型分布中有量的差异，女性的CD+3CD+4细胞高于男性，而CD+3CD+8细胞低于男性［3～5，8，9］。在我们的研究中也观察到这一细微变化，CD+3CD+4细胞在女性均值为1 021/μl（39%），男性均值为925/μl（38%），CD+3CD+8细胞女性均值为688/μl（27%），男性均值为710/μl（29%）。关于CD+3细胞的情况众说不一［2，4，7］，我们的研究与Reichert的研究均显示无性别和年龄差异。总之Dworsky［8］认为即使存在差别，也会随年龄增长而消失，甚至逆转。多数作者认为一般情况下，使用男女共同参考值就够了，只有在针对某一性别的特殊研究时才值得做性别参考值。
众所周知，淋巴细胞的亚群分化及抗原表达与年龄紧密相关［1］。婴幼儿期表达CD4和CD19的百分率与绝对数高于成人，且随年龄增加而减低；而表达CD8和CD16/CD56的百分率与绝对数低于成人，且随年龄增加而增加，这种变化直到5岁才达到成人水平。青少年与成人之间无明显差别。成人的研究发现随年龄增加，CD+3CD+4细胞略有升高，而CD+3CD+8细胞略有降低。我们在大、小年龄组比较中也可观察到同样的变化，但以上改变在我们的研究中并无统计学意义。Tollerud认为在20～70岁年龄段，这种改变不会大于10%，故可建立统一的参考值。
从表3中可发现中国人淋巴细胞免疫表型变化最明显的是NK细胞的高水平。无论百分率与绝对数都高于欧美的研究，与亚洲的有关NK细胞研究恰有异曲同工之处，如Choong等报告华人的NK细胞高于印度人，Prince等［10］的研究也证实NK细胞在亚裔华人、日本人中比高加索人高，最近Webster、Lee［9］、Kam等的研究分别发现泰国人、新加坡亚裔、香港华人均有较高的NK细胞水平。此外有些报告还注意到NK细胞在男女之间的差异［4］以及随年龄增加而增加等问题。我们的研究未发现NK细胞有年龄差异，但在大年龄组男、女比较时发现女性NK细胞的均值偏低，并与男性有显著差异。由于其分布落在男性的频数分布范围内，故未做另外的统计。
早年的研究由于各实验室细胞制备方法、荧光标记单克隆抗体的质量以及流式细胞仪的型号、操作的差异，加上研究样本量较小而使实验室相互间的参考值差别较大。随着实验技术、试剂盒质量的完善，以及在严格的室内质量控制下采用双染色来分析淋巴细胞表型，使得对于不同亚群细胞的识别更具有可定量性。这样相同种族及年龄段的淋巴细胞表型分析也随着分析样本量的加大而趋于一致并更具代表性；这使应用相同试剂、相同仪器的实验室间变异缩小，并有可能使用共同的参考值。
参考文献
1McCoy JJP, Overton WR. Quality control in flow cytometry for diagnostic pathology: II. A conspectus of reference ranges for lymphocyte immunophenotyping. Cytometry, 1994, 18：129-139.
2Choong ML, Ton SH, Cheong SK. Influence of race, age and sex on the lymphocyte subsets in peripheral blood of healthy malaysian adults. Ann Clin Biochen, 1995, 32(pt6)：532-539.
3Kam KM, Leung WL, Kwok MY, et al. Lymphocyte subpopulation reference ranges for monitoring human immunodeficiency virus-infected chinese adults. Clin Diagn Lab Immunol, 1996, 3： 326-330.
4Webster HK, Pattanapanyasat K, Phanupak P, et al. Lymphocyte immunophenotype reference ranges in healthy thai adults: implications for management of HIV/AIDS in Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 1996, 27：418-429.
5Tollerud DJ, Clark JW, Morris-Browm L, et al. The influence of age, race and gender on peripheral blood mononuclear cell subsets in healthy nonsmokers. J Clin Immunol, 1989, 9：214-222.
6Reichert TA, De Bruyere M, Dencys V, et al. Lymphocyte subset reference ranges in adult caucasians. Clin Immunol Immunolopathol, 1991, 60：190-207.
7Goto M, Nishioka K. Age and sex-related changes of the lymphocyte subsets in healthy individuals： An analysis by two-dimensional flow cytometry. J Gerontol, 1989, 44：M51-M56.
8Dworsky R, Paganinitlill A, Ducey B, et al. Lymphoyte immunophenotyping in an elderly population: age, sex and medication effects-a flow cytometry study. Alech Ageing and Development, 1989, 48：255-256.
9Lee BW, Yap HK, Chew FT, et al. Age- and sex- related changes in lymphocyte subpopulations of health asian subjects: from birth to adulthood. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry), 1996, 26：8-15.
10Prince HE, Karim H, Waldbeser LS, et al. Influence of racial background on the distribution of T cell subsets and Leu II positive lymphocytes in healthy blood donors. Diag Immunol, 1985, 3：33-37.