程远辉，张兴:分子标记技术在中药鉴定中的应用

(西南大学农学与生命科学学院，重庆400716)
    我国中药资源极其丰富，但由于各种原因造成的大量宝贵资源的破坏已使部分药用资源濒临绝迹；另外某些不法人员惟利是图，以假乱真，从而导致中药市场的混乱，严重影响了药材的质量和药效的稳定。因此加强中药资源的调查、种质的鉴定研究和分类保护是当务之急，是实现我国中药现代化的基本保障。用作中药种质研究的方法有多种，包括最初的形态学标记研究；细胞学标记技术即核型分析和解剖学鉴定；随后产生的生化大分子标记包括同功酶和蛋白质指纹标记；也有通过化学成分进行种质鉴定和分类。但以上各种途径所获结果都要受环境条件影响或植物本身的限制，或者是操作烦琐，花费较多人力、物力，更为致命的是它们技术本身所存在的弊端导致所得结论并不是种质遗传性状的直接反映。而分子标记可以比较直接的反映作物的遗传特性，特别是分子标记技术的快速发展和应用使中药种质从分子水平即真正意义上的鉴定成为可能。此类技术在中药资源整理、种质鉴别和研究等工作中已得到广泛的应用，本文将简述各种分子标记技术及其在中药种质研究中的应用和进展。
    分子标记或称遗传标记，本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。这种DNA片段是由基因组DNA经限制性内切酶切割、PCR扩增、分子杂交后在电泳胶上检测到的。分子标记技术也称DNA分子诊断技术，是基于研究DNA分子由于缺失、插入、易位、倒置、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性，其检测技术，即分子标记技术口。DNA分子标记技术因具有快速准确、多态性高，不受组织类别、材料多少、发育时期和环境条件的限制等诸多优点，而使其成为目前种质资源鉴定的重要
手段之一。其大致可分为以下3类。
1  以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术即RFLP。
    RFLP(Restriction fragment length polymor—phism)是“限制性片段长度多态性”的英文缩写。RFLP是由于不同个体的等位基因之间发生变异而引起的，很大的DNA分子可以使被限制性内切酶降解成许多长短不一的较小片段，所产生的这些片段是特异性的，这种特异的DNA条带含有生物所特有的“多态性”或称“指纹”，利用同位素(通常用P32)探针，与转移于支持膜上的基因组DNA进行Southern杂交，在电泳胶上会出现特征谱带，显示限制性酶切片段的大小，来检测不同遗传位点的等位变异(多态性)。RFLP标记特点是共显性，可以区别纯合和杂合基因型，而且稳定、重复性强，目前在某些生物体中开发的RFLP的探针已经遍及整个基因组。但是RFLP存在较多缺点，如对DNA需要量较大，过程较为复杂，所需的放射性探针对人体危害较大。而分子标记技术用于药用资源鉴定的时间较晚，所以起点相对较高，RFLP由于其技术本身存在的严重弊端而用在中药研究上较少，常作为一种辅助手段。赵宣等人用此方法成功的分析了牡丹组植物种间的关系，并获得了相应的分子证据。此技术在医学上有所发展外，在植物学研究上已经淘汰，在中药上的应用前景也不被看好。
2以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术，如RAPD(Random amplified polymorphism
 DNA)、SSR(Simple sequence repeat)及AFLP(Amplified restriction fragment polymorphism)o2．1  RAPD是随机扩增多态性DNA的英文缩写，是建立在PCR技术基础上，由美国Williams等人1990年发明的一种新型分子标记技术。它是以一系列不同碱基的随机排列的寡核苷酸单链为引物(一般10碱基)，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物片段的多态性，也就反映了基因组相应区域的DNA片段多态性。这种标记在不需要知道DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹模式，而且需要DNA量少，可以产生丰富的多态性，
操作简便易行。黄璐琦等对人参栽培群体进行了RAPD分析，共筛选出18个10碱基随机引物用于PCR扩增，其中17个供试样品共获得145条扩增片段，其中有53条是多态的，占36．5％。聚类分析结果表明，大马牙类型内各品系间的亲缘关系近于二马牙类型各品系间的亲缘关系，从分子水平上证明根据表征性状对栽培类群进行划分是可行的嘲。任冰如等用RAPD方法分析了苍术不同居群间的亲缘关系。选取10条随机引物对苍术的10个居群共83个个体进行扩增获得100个DNA片断。用RAPD分析软件计算了不同居群间的遗传距离，并用类平均法作出了聚类图。王鸣刚等以不同地区的3种15组甘草种子为料，探讨RAPD分子标记在研究、鉴定甘草亲缘关系中的可行性，结果15组甘草植物的平均遗传距离为0．41，其中采自甘肃民勤野生甘草与采自新疆布尔津乌拉尔野生甘草遗传距离最小，为O．26；而采自内蒙古杭锦旗上海升袖的野生甘草与采自青海贵德的乌拉尔野生甘草遗传距离最大，为0．63。由RAPD聚类分析结果得出15组甘草植物之间的亲缘关系与形态学分类结果存在差异。此外，杨美华等用此技术对正品和伪品大黄进行了鉴别研究，也显示出分子标记技术相对于其它技术在精确度上的优越性。
    RAPD在中药种质研究上的应用最为广泛，但其最大的缺点是引物为单链且短，对反应条件较为敏感，重复性差，从而限制了其发展。
2．2  SSR又称简单重复序列SSR，是一种真核生物基因组中普遍存在的重复序列，而不同物种其重复序列及重复单位数都不同。根据这些重复序列两端设计一对特异引物，经PCR扩增、PAGE电泳及放射自显影，可以得到因简单序列重复单位数不同而引起的扩增片段的多态性。这类标记所揭示的多态性高，信息量大，重复性和可靠度高。但是，由于 需要针对每个染色体座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列以设计引物，因而需一系列建立基因组文库、克隆识别与筛选、测序等过程，要克隆足够数量的SSR，并对其进行测序和设计引物，对于初学者来说难度较大_9]。直接利用SSR对药用植物进行研究的不多，只看到外国学者Akihiro Konu—ma等发表的关于蓼科植物何首乌不同种质的生态适应性的一篇文章。但在SSR基础上发展起来的ISSR标记(Inter-simple sequence repeat)是以微卫星重复序列作为引物来检测物种多态性的新型标记技术，在我过中药种质研究中已得到广泛应用。周延清等用ISSR标记技术对怀区地黄的8个品种和2个茎尖脱毒培养系进行了遗传多样性分析，结果从44个ISSR引物中筛选出10条表现较好的引物，十条引物共扩增出110条带，利用SPSSlO．O软件分析，构建了分子树状图，将怀区地黄的8个品种和2个组培系分为两类，而且主成分分析支持上述聚类分析结果。孙悦等采用ISSR技术对南、北五味子基因组DNA进行PCR扩增，结果9个ISSR引物中有3个扩增出多态性好的条带，根据其琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带型差异可迅速区分南、北五味子。表明ISSR技术是在分子水平上鉴别南、北五味子一种行之有效的办法。此外，邱英雄等对7个不同野生群体的明党参和1个栽培群体的川明参进行ISSR分析，共检测到152个位点，总的多态性位点百分率P为90．8％，群体遗传分化值Gst为57．5％，获知明党参群体水平的遗传多样性高于川明参群体，并通过ISSR分析筛选出了川明参一个特有的分子标记。ISSR因其技术的稳定性和操作的简捷性等优点在中药领域研究中独树一帜，也必将得到更为充分的应用。③AFLP是  RFLP技术和PCR技术的完美结合，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，随后以接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点，进行扩增，最后分离扩增的DNA片段。这种方法由于结合了RFLP和PCR的优点，具有多态性好，重复性强且精确等诸 多优点，但此技术需要学者具有较高的理论知识和试验技能，且费用较高，难以推广。该分子标记在大田作物应用较多，在药用植物的应用很少，其中王晓梅等通过AFLP，用48个引物组合，检测了雌雄银杏基因组DNA的多态性，筛选与银杏性别相关的分子标记，其中3个引物组合各提供了1个与雌性相关的分子标记，经Southern点杂交证实有两个标记为银杏雌性基因组所特有。这些分子标记的获得，为寻找性别特异的探针或PCR引物，用于银杏的性别鉴定奠定了基础。
3  以DNA序列为核心的分子标记技术。
    ITS(Internal transcribed spacers)测序分析技术。蒋继宏等为探讨大戟属药用植物的系统演化关系和大戟属植物鉴定提供DNA分子证据，利用PCR技术对大戟属药用植物的rDNA—ITS区碱基序列进行测定。结果6种大戟属植物的ITSl的长度范围为255～262 bp，ITS2的长度范围为214～236 bp。运用Mega2软件进行的系统分析得到大戟属内6种植物的系统进化树。分析结果与来自形态学的研究相吻合。表明此法可用于大戟属植物种间及真伪品鉴别。丁平等对巴戟天及其常见混伪品的rDNA—ITS进行了PCR扩增、测序，并运用CLUSTAL x、MEGA软件对该区进行序列分析。根据ITS序列特征构建了系统树，混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类，然后与巴戟天聚在一起，而虎刺则单独聚为一支。证明了rDNA—ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法。另外，刘春生等对细辛、柴胡药材基源和分子鉴定的研究也获得了可喜的效果。
4讨论
近年来，分子生物学技术中DNA指纹图谱的不断发展与完善，把种质资源的研究提高到一个崭新的水平。该技术不受时间、环境条件限制，特别是可以从中药干品甚至炮制品中提取少量DNA用于分子鉴别，结果精准、快捷，受到中药工作者的青睐。但目前，此类技术仅专业人士能够运用，只有加快相关引物、PCR反应等条件的标准化研究，使操作简便化，才能让更多的人掌握，为我国的中药事业做出更大的贡献。