微透析在外用制剂评价中的应用

    内病外治是中医理论精髓之一，经皮给药又是中医主要的外治方法之一。经皮给药可以避免胃肠道刺激、避开肝脏首关效应，同时能够在病变部位维持稳定持久的血药质量浓度，近年来受到越来越多制剂工作者的关注。对于经皮给药制剂，药物只有透过皮肤才能在局部或全身发挥作用，而目前对经皮给药制剂的体内评价受到局部组织采样和动态监测困难、药效物质基础不明确等因素的限制，外用制剂的发展受到制约。因此，如何对经皮给药制剂进行体内外药代动力学进行评价，对外用制剂的研发具有直接的现实意义。
1  现有评价经皮给药制剂药代动力学的方法
1．1体外扩散池法
    两室Franz扩散方法、流通池扩散方法是目前最常用评价药物透皮吸收的方法。所用材料为离体动物、人皮肤或人工膜。其主要优势是实验条件可以得到准确的控制，但也还有明显的不足之处。对高乌甲素透皮吸收不同接收液的比较研究发现，以生理盐水／乙醇液为接受液的所拟合方程的透皮速率常数为最高，提示接受液加入一定浓度的乙醇在提高高乌甲素的溶解度的同时，可使角质层膨胀疏松，增加皮肤的通透性，从而减少时滞。对于在生理盐水中溶解度较小的药物，选择何种接收液能模拟人体的正常状态是目前的一个难点，特别是一定有机溶媒的存在，会改变角质层的结构，虽然得到的稳态渗透速率或累计渗透量增加，但并不符合生理情况。皮肤的处理和贮藏也可能影响到皮肤的屏障功能，虽然目前尚无明确的结论，但一些研究表明，冷冻前皮肤组织的水合作用可能影响到其后的通透特性[2-3]。因此，离体研究结果不能准确反映药物在皮肤中的吸收、分布、代谢、转归等局部药代动力学过程。
1．2体内血浆药物浓度法
    该法是目前最常用的评价药物透皮吸收的体内分析方法。对于经皮给药系统(TDD)，此方法能直接反映药物的药代动力学过程。如东莨菪碱、硝酸甘油、可乐定、雌二醇、睾酮、芬太尼等局部给药可以提高全身血药水平，通过监测血药浓度，可为药物的治疗提供依据。而对于局部作用的药物，由于药物在作用部位发生代谢、分解等各种反应，血药浓度和作用部位药物浓度的等效性、相关性有待考察。
1. 3局部组织药物浓度法
    对于经皮给药发挥局部疗效的药物来说，测定皮肤中药物的浓度是进行皮肤药代动力学研究的基础，因此，皮肤样品的取样就成为关键。目前常用的取样技术有起袍技术、胶带剥离术、皮肤表面药物回收法、皮肤组织活检等方法。但无论何种方法都有其局限性，如起袍技术和胶带剥离术无法对真皮内的药物进行测定，皮肤组织活检对机体的损失较大。
2微透析原理及影响因素
2．1基本原理
    微透析(microdialysis，MD)技术是一种新型生物采样技术，是利用物质沿着质量浓度梯度进行扩散和小分子化合物具有通透性原理而设计的。在组织中植入半透膜探针，通过体外微量泵使灌流液流经探针，游离的小分子药物会沿质量浓度梯度扩散进探针被灌流液带出，而蛋白质结合型药物及其他大分子物质因不能通过半透膜而被排斥在探针之外，通过测定流出液待测物的质量浓度，研究组织细胞外液中待测物的水平及其变化过程。
    MD最早应用于神经领域  ，经皮MD技术是借用神经生理学和神经化学研究神经递质的方法，应用透析膜动态地采取真皮组织间液的样本，结合其他现代敏感检测技术和设备，高效液相色谱仪、高效毛细管电泳法以及高效液相色谱与质谱联用技术等，研究局部皮肤生理代谢或疾病发生发展规律以及皮肤药代动力学。由于MD探针的透析膜可将皮肤中蛋白质、酶等大分子物质截留，透析液可不经预处理，直接进行分析，在经皮给药制剂的评价中具有在体(in vivo)、原位(in situ)取样和能够在线(0n line)、实时(real time)检测的优点，使其特别适用于组成成分多样、体内过程复杂的中药经皮给药研究。
2．2影响因素
    在MD探针中，灌注液的连续流动导致了药物在组织液和灌注液之间的扩散不能完全达到平衡，所测得透析液中药物浓度只是探针周围样品基质中该药物实际浓度的一部分。因此，利用MD探针进行组织浓度的测定，需要通过相对回收率加以校正。在经皮MD探针回收率的测定中，影响相对回收率的因素包括体内因素和体外因素，体内因素有药物的细胞吸收、主动
转运、代谢速率、蛋白结合等；体外因素有温度、半透膜性质及膜面积大小、灌注液成分及灌流速度等Is-T]。Groth等  还发现，回收率与药物的性质相关，得出经皮MD适用于亲水性、蛋白结合率较低及相对分子质量较小的药物，而亲脂性药物的经皮MD 方法尚需完备的结论。此外，探针的植入位置，特别是对植入部位造成的损伤也将影响回收率的测定，因此，在植入探针后一般经过一段时间的恢复后再进行测定。
3微透析在经皮制剂评价中的应用
3。1局部药代动力学研究
    ~Ⅱ)用于经皮制剂局部药代动力学的研究是MD技术最成熟的应用方向。特别是在中药经皮给药制剂的评价中应用越来越广泛。张氏等  通过MD技术一同位素示踪法联用进行了青藤碱贴剂的皮肤局部药代动力学研究，并对数据进行了房室和非房室模型拟合。张氏等  用MD采样技术建立了乌头碱的测定方法，并对经皮给药药代动力学进行了研究，证明反透析法可作为MD研究中乌头碱回收率的测定方法。
3．2生物利用度研究
  ‘利用血液MD探针可以测定经皮给药后血液中的药物浓度，了解该药物的血液药代动力学及进行生物利用度的计算。基于大鼠皮肤、血液双位点同步MD体系，刘氏等““采用MD结合高效液相色谱一质谱联用技术测定丹皮酚微乳、微乳凝胶及市售丹皮酚软膏在大鼠皮肤、血液中的浓度随时间的变化过程，并对其药代动力学参数进行对比研究。结果表明，丹皮酚微乳、微乳凝胶与软膏相比，显著提高了药物在皮肤组织中的浓度，具有更好的透皮效果和局部治疗作用。血液药代动力学结果表明，微乳凝胶与市售软膏具有相近的生物利用度，但微乳凝胶具有更平稳的血药浓度，有效地降低了药物的全身不良反应。郑氏  采用MD取样技术结合高效液相色谱串联质谱方法研究了氧化苦参碱凝胶剂经皮给药后，在大鼠皮肤和血液中氧化苦参碱及其代谢物苦参碱的浓度一时间动态变化过程，并发现氧化苦参碱经皮给药后存在生物转化，丰富了药物代谢的研究内容，为临床合理用药提供了依据。
3．3生物等效性研究
    由于体内有代谢酶影响，及皮肤水合程度和角质层不同，体外方法不能反映药物体内消除过程，仅用体外模型研究经皮制剂所得结果不完全可靠。对于外用制剂的体内评价，美国食品药品管理局(FDA)要求，剂型改良后的局部制剂都应提供生物等效性研究数据。凌氏等  以不同工艺制备青藤碱的普通凝胶贴剂和脂质体凝胶贴剂，以裸鼠为实验动物，经皮给药后，分别采用组织匀浆法及MD法对青藤碱的体内药量进行测定，MD法的检测结果显示，在整个测定过程中，脂质体凝胶贴剂比普通凝胶贴剂具有更高的皮肤局部瞬间药量，且皮肤局部药时曲线与国际上报道的大多数经皮吸收情况相符。Brunner等   对一种新型双氯芬酸喷雾凝胶经皮给药后的血药浓度、皮下组织和骨骼肌分布与双氯芬酸钠口服制剂进行比较，以经皮MD
测定皮下脂肪的药物浓度，结果表明，凝胶剂的相对生物利用度皮下和骨骼肌分别为口服药的344％和209％，而血药浓度仅为口服给药的50％，因此，认为新剂型具有良好的局部渗透
性和较低的系统分布。可以作为口服制剂的替代剂型用于软组织炎症的治疗。
3．4药效学研究
    MD探针的选择性和分子量的大小有关．在药效学的研究中选择大截留值的探针可以采集内源性物质，如炎症递质组胺、内皮素一1、血小板活化因子、缓激肽、乙酰胆碱、神经肽
以及前列腺素等，从而对经皮制剂的药效学进行研究，有助于阐明一些药物如H-1受体拮抗药盐酸西替利嗪、氯雷他定以及中药青藤碱等的具体作用环节。Brazis等  研究了环孢菌素A对比格犬皮肤组胺和前列腺素D2(PG-D2)水平的影响，结果表明，组胺水平在治疗15～30 d之后显著下降，但PG-D2水平无显著变化，说明环孢素A是通过抑制组胺释放发挥抗炎作用的。
3．5体内外相关性研究
    对于经皮制剂的评价，最重要的是能将体内和体外的数据进行相关性分析，以期用体外的方法预测药物的体内过程。Krei l aard等   报道，应用Franz扩散池和MD技术分别测定利多卡因和盐酸匹罗卡因的不同经皮给药剂型的透皮吸收率，发现2种评价方法具有较好的相关性[利多卡因(r=0．97)，盐酸匹罗卡因(r=0．86)]，但不同模型药物之间的体外／体内透皮吸收率无相关性。熊氏等  采用高效液相测定法测定醋酸地塞米松和地塞米松磷酸钠在不同pH值环境中的油水分配系数，并采用改良型Franz扩散池装置通过体外透皮扩散实验得到2种药物的经皮渗透速率，通过MD技术将线性探针植入大鼠腹部皮下，得到2种药物的体内皮下透过总量，再分别对醋酸地塞米松和地塞米松磷酸钠的上述3种参数进行相关性考察。发现醋酸地塞米松的体外经皮渗透速率与油水分配系数、体内皮下透过药物总量与油水分配系数均具有良好的负相关性；而地塞米松磷酸钠的体外经皮渗透速率与油水分配系数、体内皮下透过药物总量与油水分配系数均具有良好的正相关性。但也有研究表明，体外实验和体内结果差异较大。一项应用MD技术分别测定小鼠离体和活体的透皮吸收情况的研究发现，体外的测定结果是活体测定结果的近40倍，提示应用体外透皮实验得到的药物质量浓度并不能作为体内实际的药物水平的可靠指标。
4结语
    经皮MD由于对皮肤的刺激小、插入位置准确、可以在体连续取样等诸多优点，在外用制剂的体内评价中已得到广泛应用。但其局限性也非常明显，如个体差异性大、探针的重复性不好、灌流液选择局限、对蛋白结合率高及亲脂性药物的取样困难等。随着探针制作技术的进步，实验操作的标准化，灌流液中加入改性剂如a 、B或r，型环糊精的方法以提高亲脂性药物及其代谢产物在MD取样中的回收率  ，MD在经皮制剂评价中的应用范围将大大拓展。