应用代谢组学探讨中医体质与证候关系问题

    随着系统生物学的出现，单一、孤立地看待生命体已不能适应科学研究的发展，其忽略了生命体的复杂性及整体性，在现代医学研究中的局限性已日益突出。代谢组学的应用使系统生物学得以快速的发展；同样，将代谢组学应用于中医药研究，揭示其物质基础，也将有利于中医药的现代化。
  世界卫生组织在《迎接21世纪的挑战》报告中指出，2l世纪的医学将从“疾病医学”向“健康医学”发展，从“群体治疗”向“个体治疗”发展。因此，“个体化”的思想将渗透在未来医学的发展中。中医体质学研究思路与中医证候研究思路均体现了个体化诊疗思维模式。中医体质学说为个体化诊疗开辟了新途径，而中医辨证论治是个体化诊疗的范式，在实施个体化诊疗的过程中均占据了重要的地位。长期以来，证候与体质孰前孰后、孰轻孰重一直是学者探讨研究的重点问题。应用代谢组学探讨中医体质与证候的关系，能更准确反映生物体系的状态，揭示机体的代谢本质，从而进一步挖掘其实质，阐明二者的关系。
1关于代谢组学
  Steven Oliver E13研究小组在1997年提出了通过对代谢产物的定量和定性来评估酵母基因的遗传功能及其冗余度，并率先提出了“代谢组(metabolome)”的概念。所谓metabolome，是基因组的下游产物，也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是针对分子质量小于1000的内源性小分子。英国Nicholson等  于1999年首次提出代谢组学(metabonomics)的概念。metabonomics是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物变化或其随时间的变化，研究生物体系的代谢途径的一种技术。metabonomics研究一般包括样品采集和制备、代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标志物识别和途径分析等步骤。生物样品(如尿液、血液、组织、细胞和培养液等)采集后进行生物反应灭活、预处理，运用核磁共振、质谱或色谱等检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化，得到代谢谱或代谢指纹，而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，并研究相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规律，以阐述生物体对相应刺激的响应机制，实现分型和发现生物标记物。
2代谢组学与中医体质研究
    个体差异的形成不仅受先天遗传因素的影响，同样也会受到后天环境因素的影响，而后天因素的影响与个人生活环境、生活条件密切相关。因此，以基因组学和蛋白组学为基础的个体化医疗存在一定的局限性，而metabonomics是一种反映即时体内外变化的综合分析方法，在个体化诊疗方面具有重要意义。如Lenz等  收集了给予标准饮食的12名健康男性的血浆和尿液，与相隔14 d的血浆和尿液进行核磁共振检测比较，应用主成分分析进行数据分析。结果发现，血浆的差异很小，但尿液存在个体差异。
    中医体质研究是个体化研究的重要体现。体质的呈现因性别、年龄、生活环境、饮食习惯、情绪因素的不同而各异。体质也通常表现为结构、功能、代谢以及对外界刺激反应等方面的个体差异。关于体质的分子生物学研究、生理生化指标检测均发现了体质差异客观存在的依据，如王氏等  研究发现阳虚质、阴虚质、痰湿质与平和质比较具有独特的基因表达谱，并通过对PPARD、PPARG、APMI和UCP2共4个基因多态性进行检测，发现这4种体质类型分别具有特定的单核苷酸多态性分布和特定的单倍型分布；发现阳虚质甲状腺激素受体B表达下调为阳虚质不耐寒冷的表现提供了分子生物学解释；研究还发现阳虚质、阴虚质与下丘脑一垂体一肾上腺轴、下丘脑一垂体一甲状腺轴功能减退及环核苷酸系统和免疫功能紊乱具有一定的关联性。尽管分子生物学的研究数据为体质差异的客观存在提供了依据，但只有metabonomics研究反映的是已发生的生物学事件。通过对不同体质代谢产物的检测，能够进一步印证体质差异存在的客观物质基础，使个体化的认识更加全面和深入。
3代谢组学与中医证候研究
    中西医学的文化背景、思维习惯存在着较大的差异，因此，中医学对人体生理病理的认识与西医学有差异，主要体现在中医对证的认识及辨证论治方面。辨证论治是中医学中特有的思维方法和诊疗模式。证实质的研究是研究中医的关键。但由于
研究思路、研究方法及研究手段的局限性，使证候的研究难以取得突破性的进展，故亟需建立符合自身特点的方法和技术。metabonomics是目前一项比较适合证候学研究的技术手段。metabonomics的研究方法与中医学的整体观念、系统观念甚至辨证论治思维具有相通性，与中医证候的整体动态性相一致。因此，采用metabonomics技术，结合有效模式识别，通过对与某一证候相关的特定代谢组分进行识别、分析、判断，有望确定相应证型，能使中医辨证更加客观。而且，metabonomics技术的应用能避免中医传统四诊方法的局限性，可从人体代谢  物组的角度对方证相应的现代内涵提供依据。
    中医证候metabonomics研究技术通常先进行所选疾病的中医辨证分型，再通过采集证候样本或模型动物的血浆、尿样品或其他体液，进行代谢产物谱分析，得到各自的代谢产物谱，找出特异的标志性代谢产物，用生物信息学方法分析生物标志物的功能，筛选、鉴定与各证型相关的生物标志物群，以确定“证相关代谢谱群”；还可建立中医证型与生物标记物群的多元回归模型，探索中医“证”的物质基础和分子生物学诊断指标。如罗氏等  通过慢性束缚应激大鼠(肝郁脾虚模型)血浆代谢表型的改变，开展中医证候学的研究。对大鼠血氢核磁共振波谱(1H NMR)的主成分分析表明，各组动物代谢谱各不相同，与已知应激状态下动物体内代谢的调节过程及结果相一致。通过正常对照组与模型组相比较，发现醋酸，乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3．44 ppm的未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。这些发生改变的代谢物可以作为肝郁脾虚证的生物标志物做进一步的研究。李氏等  利用基于1H NMR的组学分析方法研究气虚血瘀证大鼠对比于正常大鼠尿液的组成变化，发现病变大鼠尿液中甲酸、肌氨酸酐、a- 酮戊二酸、柠檬酸、牛磺酸、氧化三甲胺、琥珀酸、马尿酸成分的含量发生了变化，为进一步提示气虚血瘀证的产生机制和病证治疗提供了证据。童氏 对慢性胃炎湿热蕴脾证患者和正常组唾液进行了代谢产物分析，2组代谢产物有明显区别，白氨酸、苯丙氨酸等指标存在显著差异。高氏等  使用氢化可的松诱导大鼠建立肾虚证模型。-HNMR分析对照组和模型组大鼠的尿液，使用主成分分析方法进行模式识别。结果显示，与对照组比较，肾虚组大鼠由于氢化可的松诱导，大鼠机体进入一个过消耗后衰弱的状态，相关代谢发生显著变化。乳酸(61．37)代谢发生堆积，二甲胺(62．72)的含量增加，天冬氨酸(62．83)、牛磺酸(63．44，3．28)、马尿酸(87-84、7．56、7．64、3．97)、肌氨酸(63．87)等的相对积分面积明显下降。该研究为深入认识和理解中医肾虚证的本质提供了依据。以上研究表明，不同证型发生的生物学事件是不同的。因此，寻找相关证型的代谢标志物可以客观描述证阶段所表现的状杰及证候的类型．
    中医学重视机体的整体状态，注重证的论治。中医师在辨证论治时依赖四诊所收集的信息作出判断，但在此过程中大量的信息难以量化，且医生的诊疗水平各异，辨证结果差异很大。难以标准化。这限制了中医临床标准化和客观化数据的积累。metabonomics是对机体代谢事件的全面跟踪和评价，能逐渐避免在西医的“病”下才能研究中医的“证”的机械规范及孤立、静止的研究所造成的误区。
4展望
    目前，metabonomics已广泛应用于各个领域，在药物开发、临床诊断、微生物和植物营养科学、中医药学中的应用都具有广阔的前景。中医药现代化需发挥自己的特色和优势，同时还需建立国际认可的机理及疗效评价体系。中医药学是复杂性科学，也是系统生物学与个体化医学相结合的实践性科学。中医药现代化的研究与metabonomics研究相结合将会产生重大影响。用现代语言来阐释中医药学以及体质和证的本质是中医药学发展的关键所在。
    相关研究结果已初步显示体质、证候的一些潜在生物标志物。通过对差异代谢物的生理功能和代谢途径进行阐述，发现体质与证候具有能量代谢、脂代谢、糖代谢、氨基酸代谢等方面的差异  。基于此，笔者认为，metabonomics能为研究中医体质与证候的关系问题提供新思路，并能从客观本质上解释二者的关系。除了能很好地说明体质与证候的共性与个性问题外，metabonomics还能为体病相关研究搭建一个很好的平台。