点击显示 收起
本实验过以高脂饲料喂养的方法制造单纯性肥胖大鼠模型，并采取穴位电针刺激方法，观察电针刺激对大鼠摄食量、体质量的影响，并检测血液中瘦素(Leptin)、神经肽Y(NPY)等摄食和能量代谢相关激素的变化。
1材料与方法
1．1动物健康刚断乳的SD雄性大鼠38只，体质量65-80 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1．2试剂与仪器Leptin放免试剂盒，购于北京科美东雅生物技术有限公司。NPY放免试剂盒，购于北京科美东雅生物技术有限公司。G805电针治疗仪，福建医疗器械厂生产。
1-3分组与造模 随机分为两组，对照组8只，普通饲料喂养，高脂组30只，高脂饲料喂养(普通饲料60％、猪油12％、蔗糖5％、奶粉5％、花生5％、鸡蛋10％、麻油1％、食盐2％)Ⅲ。动物居住环境温度控制在25～30℃．湿度适宜，通风良好，明暗周期12 h，所有大鼠在造模期间自由摄食和饮水，每日晨暮各更换1次食水。每日记录摄食量、饮水量，每周定时测量体质量。14周后。若高脂组大鼠体质量超过空白组大鼠平均体质量的20％，且其体质量连续2周内周增幅>10 g认为单纯性肥胖大鼠模型造模成功。有15只大鼠造模成功。将造模成功的大鼠随机分为两组，模型组7只，针刺组8只。
1．4针刺方法针刺时间固定在每日下午3：00-5：00，由专人操作。将实验组大鼠放入自制的固定器中固定，用75％酒精消毒后，用36号美容针直刺双侧后三里5 mm，直刺双侧内关穴1 mm，接通G805电针治疗仪，采用频率为15 Hz，强度为1．5 V的连续波，每穴刺激时间为15 min，每日1次，连续治疗4周。模型组和对照组大鼠采取同样的方式每日固定15 min。在为期4周的针刺过程中，控制环境温度在25-30℃，模型组和针刺组大鼠继续以高脂饲料喂养，对照组大鼠用普通饲料喂养，所有大鼠在造模期间自由摄食和饮水，每日晨暮各更换1次食水。每日记录摄食量、饮水量，每周定时测量体质量。
1．5标本采集与检测 实验结束后，将大鼠禁食过夜，次日早晨断头处死，同时留取血样。(1)Leptin测定：取全血2mL．37℃放置30min后，3000 r／min，4℃离心5min，分离血清，采用非平衡法，具体操作按说明书进行，用放射免疫计数器计数，由高年资专业放射免疫技师操作。(2)NPY测定：取全血3 mL，注入含10％EDTA Na230 IxL和抑肽酶40 IxL的试管中，4℃3000 r／min离心10 min．分离血浆。为排除蛋白质的干扰，采取酸性乙醇提取法，具体步骤如下：取血浆0．5 txL加1uL酸性无水乙醇(100 mL无水乙醇+冰醋酸1．2 mL)，放震荡器上震荡l min，4℃离心15 min，将上清倒入青霉素瓶内．在45°c 水浴锅上蒸干(24 h即可完全干燥)封口，一20℃保存。测定前每瓶加入pH7．4 PBS 0．5uL溶解，混匀,倒人试管，-20℃4 h以．上完全冻结，然后放置4℃溶解，取上清200 p,L测定用，测定采用非平衡法，具体操作按说明书进行，用放射免疫计数器计数，由专业高年资放射免疫工作者操作。
1．6统计学处理应用SPSSl2．0统计软件。以(x5)表示．数据进行方差齐性检验、单因素方差分析、多个样本均数间两两比较(SNK)、非参数检验等。P<0．05为差异有统计学意义。
2结 果
2．1 一般情况实验过程中，对照组和针刺组大鼠各死亡1只。对照组大鼠活泼好动，皮毛清洁有光泽：肥胖组大鼠行动迟缓，皮毛油腻污秽，对外界反应迟钝：针刺组大鼠反应稍迟缓，皮毛色泽暗，但比模型组有光泽。
2．2穴位电针刺激对大鼠体质量和摄食的影响 在针刺开始前，针刺组和模型组大鼠的平均摄食量都为25 g／d，针刺1周后针刺组大鼠的平均摄食量为16g/d并持续此水平直至实验结束，但模型组大鼠的摄食量却并没有明显变化(见图1)。如表1所示，在为期4周的针刺过程中，对照组和肥胖组大鼠体质量缓慢上涨．而针刺组大鼠体质量在逐渐减少。针刺第1周后即可发现针刺组大鼠和肥胖组大鼠的体质量有明显的差异(P<0．05)。
2．3穴位电针刺激对大鼠血中NPY和Leptin水平的影响 见表2。经过四周的体表穴位电针刺激后，针刺组大鼠血中Leptin和NPY水平，明显低于模型组：虽然针刺组NPY和Leptin水平依旧高于对照组大鼠．但是无统计学意义(P>0．05)。
3讨论
肥胖症是一个以脂肪过多储存为主要表现的慢性疾病常伴有代谢紊乱、代谢调节和神经及内分泌的异常。Leptin是一种主要由白色脂肪组织分泌的蛋白质类激素，它是肥胖基因(OB基因)的编码产物。其不但存在于胃主细胞和壁细胞，也存在胃底的内分泌细胞中。故从某种意义上来说，Leptin也可以算一种胃肠肽类激素。Leptin由脂肪组织分泌后，进入血液循环。其通过与下丘脑相关的反馈环实现抑制摄食作用。研究表明Leptin水平的高低与体内脂肪组织蓄积成直接比例关系。NPY是1982年首次从猪脑中提取的一种含36个氨基酸的单链多肽，属胰多肽家族。现在认为NPY参与摄食的启动与维持，是下丘脑中最重要的食欲促进因子，在下丘脑食欲调节网络中起着重要的作用。
本实验采取孙志等推荐的高脂饲料配方，用刚断乳的SD雄性大鼠(约1月龄)造模，由于这些大鼠未曾接受过普通饲料喂养，故对高脂饲料较为适应。由于遗传、个体差异等方面的影响，14周后，30只大鼠中只有15只制作单纯性肥胖模型成功，造模成功率为50％。本实验观察到，经过1周持续规律的电针穴位电针刺激后，单纯性肥胖大鼠的体质量以及摄食量即可明显下降，而持续四周的穴位电针刺激可以使单纯性肥胖大鼠的体质量持续下降，但摄食量却无明显变化。另外，本实验检测到单纯性肥胖大鼠血清Leptin和NPY表达量比正常对照组明显升高，并且体表后三里和内关穴位电针刺后针刺治疗后针刺组肥胖大鼠血Leptin和NPY表达下降。实验显示针刺可以影响单纯性肥胖大鼠体质量和摄食量同时伴随有血液中NPY和Leptin水平的改变，并且这种变化并不是由于应激的影响 ，提示电针刺激可能通过调整肥胖大鼠能量代谢的重要信号分子之一NPY水平，发挥减轻体质量和抑制食欲作用，而肥胖大鼠体质量下降的同时．可能是因为反馈调节，Leptin水平随之下降。