动脉粥样硬化免疫机制 的研究进展
南华大学心血管病研究所 杨永宗
2005.8.15.
一、前 言
AS病变的炎症性质以及一系列炎性因子在AS病变形成中的关键作用几已成为共识。
但数以百计的危险因素如何启动炎症过程而促成AS病变发生发展却还是个未解的问题。
天然免疫的模式识别理论的提出将开辟AS病变发生发展机理研究的新领域。
二、天然免疫模式识别理论要点
美国免疫学家Janeway提出天然免疫的模式识别理论，强调天然免疫对获得性免疫的指导和调控作用，指出抗原递呈细胞（APC）是紧密地连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。
天然免疫系统通过APC上的模式识别受体(PRR)识别病原相关分子模式(PAMP)，区别“自己”与“非己”及无害“非己”和病原体相关“非己”,并籍抗原递呈和共刺激信号两个环节赋予获得性免疫识别“自己”“非己”的能力。
病原相关分子模式 （pathogen-associated molecular pattern）
PAMP是指一大组或某几大组病原体所共有的一种分子模式(molecule pattern)，而非某一特定结构。
PAMP是病原体的保守结构成分且对其生存是必要的,如发生突变,将使病原体死亡或丧失致病性。
PAMP不同于宿主机体自身成分。
Janeway提出模式识别理论，将天然免疫针对的主要靶分子信号称为病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern,PAMP），将其相应的识别受体称为模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）。
PAMP主要指广泛存在于病原体细胞表面的分子标志，如酵母细胞壁上的甘露糖、以及各种细菌的细胞壁成分如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，这些分子在进化过程中都趋于保守。
模式识别受体 (pattern recognition receptor)
与PAMP相应的识别受体称为模式识别受体（PRR）。
已克隆的PRRｓ大多属于Toll样受体(TLRs)家族, 清道夫受体特别是SR-A1也具有PRR功能。
TLRs广泛表达在各种淋巴细胞表面，包括非特异性免疫细胞巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞，和特异性免疫Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞。
其中单核细胞分化的树突状细胞是唯一表达所有5种TLR的细胞,也是唯一表达TLR3的细胞。
1.病原微生物感染
相关病原体的研究包括肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒等。
其中肺炎衣原体在AS斑块发生中的作用已有较多研究，但现在认为单一的病原体感染在AS中的作用可能很小，而多重感染并存则是影响心血管疾病的重要因素。
内毒素的作用
Control Group
Endotoxin Group
Group vWF(%) tPA activity PAI activity
(Iu/mg protein) (Au/mg protein)
Endotoxin 0.556±0.048* 0.227±0.048* 5.36±0.28*
Control 0.100±0.050 0.643±0.080 1.25±0.40
* P<0.05 compared with control.
内毒素对内皮细胞功能的影响
Control
Coronary Artery from Patient
肺炎衣原体
A1: Control
A2: 106 IFUs/L AR-39
B1: 10 mg/L LDL
B2: 10 mg/L LDL+ 106 IFUs/L AR-39
C1: 10 mg/L oxLDL
C2: 10 mg/L oxLDL+ 106 IFUs/L AR-39
肺炎衣原体对细胞胆固醇蓄积的影响
A1:对照组 A2:cpn
B1:LDL B2:LDL+cpn
C1:ox-LDL C2: ox-LDL +cpn
肺炎衣原体对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响
多重感染并存
流行病学资料显示，冠心病患病危险度与感染病原体的种类多少相关，而且存在多种感染是冠心病患者发生心肌梗死的独立危险因素。
现在认为单一的病原体感染在AS中的作用可能很小，而多重感染并存则是影响心血管疾病的重要因素。
Circulation. 2001;103:45-51. Prospective Study of Pathogen Burden and Risk of Myocardial Infarction or Death
2.氧化修饰低密度脂蛋白
A 对照组 B 实验组
小鼠腹腔巨噬细胞
猪主动脉平滑肌细胞
人U937细胞
透射电镜照片
人外周血单核巨噬细胞
人THP-1细胞
Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp. 3893-3897, April 1995
T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein
AS患者血清和斑块可检测到oxLDL抗体。
斑块中分离出的CD4+ T 细胞可识别oxLDL。
oxLDL抗体可分为IgG和IgM型。IgG抗体水平增高与AS病变程度加重相关，而IgM型oxLDL抗体与AS病变呈负相关。
用oxLDL免疫兔可减少40%～50%AS病变，在apoE和LDLR敲除小鼠的研究中也获得类似结果。
Shaw 等人用肺炎链球菌感染LDLR缺乏小鼠，诱导小鼠体内高水平IgM型oxLDL抗体产生。伴随脾脏内B淋巴细胞持续分泌IgM增高，AS病变程度降低。
用apoB-100肽链免疫apoE缺陷小鼠，可减少60%的AS病变形成，并特异性增加IgG抗体水平[7]。
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:879-884. Inhibition of Atherosclerosis in ApoE-Null Mice by Immunization with ApoB-100 Peptide Sequences
斑块内的OxLDL可影响DC的成熟和活化，氧化过程产生的溶血磷脂酰胆碱（LPC）可直接通过G蛋白偶联受体途径诱导DC成熟。
oxLDL还可以增加DC表面呈递抗原以及协同信号分子的表达。
The Journal of Immunology, 2002, 169: 1688–1695. Mature Dendritic Cell Generation Promoted by Lysophosphatidylcholine
3.热休克蛋白
HSP可与多种抗原肽结合产生免疫原性，诱导抗原特异性免疫反应。
Berberian 最先报道在人类和兔斑块中存在HSP70，而且HSP的分布与斑块中细胞坏死、脂质聚集相关。
Kleindienst 研究表明颈动脉的内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞HSP60表达量与AS严重程度呈正相关。
斑块中大量存在的T淋巴细胞对HSP60/65可发生特异性反应。
临床研究也表明HSP60抗体与冠状动脉疾病严重程度相关，是冠脉临床事件发生的重要危险因素。]
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22:1547-1559. Role of Heat Shock Proteins in Atherosclerosis
微生物HSP65/60和人HSP60的抗体之间存在交叉反应，抗微生物HSP65/60的抗体可以引发自身免疫反应。
除了广泛关注的肺炎衣原体和巨细胞病毒编码HSP60与人HSP60分子模拟作用。
除上述交叉反应引起免疫反应外，HSP可被TLR4识别通过天然免疫在AS发生中发挥关键作用。
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22:1547-1559. Role of Heat Shock Proteins in Atherosclerosis
4.β2糖蛋白I
β2糖蛋白Ⅰ是一种含326个氨基酸的血浆蛋白，主要合成部位在肝脏，一般以游离形式存在于血浆，少量与脂质结合。
β2GpI是抗磷脂综合症（APS）的主要抗原。多种炎症性疾病，包括AS、狼疮、APS血浆中都能检测到抗β2GpI抗体，人AS斑块内也检测到β2GPI。
DOMAIN STRUCTURE OF β2-GLYCOPROTEIN I
George用人β2GpI免疫LDLR-/-鼠，抗β2GpI抗体显著增高，血管内皮下较多CD4+T细胞浸润，AS斑块形成明显加快。
用β2GpI免疫apoE-/-鼠也同样显示斑块形成速度加快，抗β2GpI抗体水平增高。
Circulation. 1998;98:1108-1115. Induction of Early Atherosclerosis in LDL-Receptor–Deficient Mice Immunized With b2-Glycoprotein I
用β2GpI免疫普通小鼠，再将其淋巴结和脾脏处的淋巴细胞注入LDLR-/-小鼠的腹腔，发现LDLR-/-小鼠早期AS斑块增加。说明β2GpI通过淋巴细胞在动脉粥样硬化的形成中发挥作用。
Circulation. 2000;102:1822-1827. Adoptive Transfer of b2-Glycoprotein I–Reactive Lymphocytes Enhances Early Atherosclerosis in LDL Receptor–Deficient Mice
四、AS与天然免疫
天然免疫是机体的第一道防线，它通过天然免疫效应细胞和效应分子发挥作用。
天然免疫效应细胞包括单核/巨噬细胞、NK细胞，树突状细胞、肥大细胞、B1细胞等；
天然免疫效应分子则有炎症介质、补体等。
单核/巨噬细胞在AS发病中具有重要地位，其他效应细胞同样可能发挥一定作用。
Kristina用半定量PCR和免疫组化方法发现，人AS斑块中TLR1、TLR2、TLR4表达明显增加，同时也伴随有NF-κB的表达。
推测TLRs在斑块炎症活化过程中天然免疫机制发挥作用。
Circulation. 2002;105:1158-1161. Expression of Toll-Like Receptors in Human Atherosclerotic Lesions: A Possible Pathway for Plaque Activation
TLR信号转导
TLR和PAPMs结合后形成二聚体,随后转接蛋白MyD88通过C末端的Toll/IL-1R（TIR）结构域与TLR的胞内段相互作用，介导LPS诱导的单核细胞或内皮细胞NF-κB活化，激活细胞因子基因转录，介导共刺激信号B7分子表达，进而通过APC而活化Ｔ