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【摘要】目的 观察锂-匹鲁卡品（LPC）致痫大鼠杏仁核神经元损伤的形态学改变，并检测细胞凋亡相关的DNA碎片标志物。方法用LPC诱发大鼠癫痫持续状态(status epilepticus，SE)3 h，于癫痫中止后第24小时和第48小时处死动物。一组鼠用于制作脑切片，分别用光镜和电镜观察；另一组从相同的脑区提取DNA，在含有溴乙锭的琼脂糖凝胶上电泳。注射了生理盐水的大鼠被用作阴性对照。结果在第24小时和第48小时两个时点，SE 大鼠杏仁核神经元出现了形态学上的坏死和梯状DNA电泳带，对照组未见到坏死及凋亡细胞。结论癫痫持续状态后，形态学上表现为坏死的神经元出现梯状DNA电泳带，提示在此模型中可能存在程序性细胞死亡的机制。
【关键词】癫痫持续状态；凋亡；坏死；DNA梯状电泳带
Mechanism of neuronal death in nucleus amygdalae of rats after lithium-pilocarpine induced status epilepticus
LIANG JueyinSUN Jianying FENG Yanqiu et al
Department of Neurology，Shandong Provincial Hospital, Jinan, 250021
【Abstract 】Objective To observe the morphology of neuronal death in nucleus amygdalae of rats after status epilepticus(SE) induced by lithium-pilocarpine(LPC), and correlate this with markers of DNA fragmentation that has been associated with cellular apoptosis. MethodsSE was induced for 3 hours with LPC.24 or 48 hours later the rats were killed.One group had brain sections stained， then examined by light and electron microscopy . DNA was extracted from the same area and electrophoresed on an agarose gel with ethidium bromide . The same rats injected with saline were used as negative controls .Results24 and 48 hours after SE，we saw morphologically necrotic neurons in nucleus amygdalae,as well as DNA ladder.Neither apoptotic nor necrotic neurons were seen in rats injected with saline. Conclusion After SE, DNA ladder was seen in nucleus amygdalae where neurons were morphologically necrotic, which suggests that programmed cell death mechanisms may be activated in this SE model.
【Key words】status epilepticus, apoptosis, necrosis, DNA ladder
癫痫持续状态(SE)可导致神经元死亡,尤其是边缘系统。曾有人认为痫性发作诱导的神经元死亡是凋亡，主要依据有TUNEL染色阳性和DNA梯状电泳带，然而，从目前所能得到的超微结构资料来看，SE后神经元的损伤以坏死为主［１，２］。因此，我们精确观察SE诱导的大鼠杏仁核神经元损伤超微形态学改变，并同时观测SE后杏仁核区DNA梯状电泳带，这对探讨SE后脑损伤的机制将提供最直接的证据。本研究还将进一步探讨DNA梯状电泳带在SE后神经元损伤中的意义。
1 材料和方法
1．1癫痫持续状态模型的建立健康成年雄性Wistar鼠40只，3~4月龄，体重250~300 g（由山东大学动物实验中心提供）。笼养，自由进水、进食，室温保持在18~25℃。将大鼠随机分为两组：锂-匹鲁卡品组(A组)和生理盐水组(B组)，再分别进一步随机分为A1、A2组及B1、B2组；其中A1、B1 为24 h处理组，A2 、B2为48 h处理组。参照文献［３］将各组大鼠用苯巴比妥（45 mg/kg）和氯胺酮（25 mg/kg）麻醉（均采用腹腔注射），并同时在颅骨上于无菌操作下置入4根不锈钢电极，置入电极后第3天分别记录各组鼠的基础脑电图。参照Fujikawa等实验方法［4］，给A组鼠腹腔内注射氯化锂（3mEq/kg）,24 h后再注射匹鲁卡品（45 mg/kg），诱发痫性发作。B组鼠给予等量生理盐水腹腔注射。当A组鼠出现典型的痫性发作后开始记录脑电图，并使痫性发作持续3 h，然后腹腔注射安定（10 mg/kg）以终止发作。在癫痫终止后第24 小时和第48 小时两个时点，腹腔注射苯巴比妥（200mg/kg），将两组动物麻醉。
1．2显微镜检查的脑片制备将鼠麻醉后，用磷酸缓冲的2%多聚甲醛和0.1%戊二醛，经心脏注射，脑灌注(灌注压为120mm Hg)原位固定。次日移取大脑，并置入Koft大脑组织保存液中。参照李伯勤主编的《医学超微结构基础》所描述的方法制备切片［５］。左半球脑片做嗜酸性染色（HE染色）后用作光镜检查，右半球脑片用作电镜检查。
1．3神经元损伤的组织学分级及统计学处理方法按照Fujikawa等［３，４］ 描述的方法，在杏仁核切片计数HE染色中嗜酸性神经元的百分比，将神经元损伤分为0~3级：0级为没有神经元损伤；0.5级为极轻度神经元损伤 （＜10%）；1.0级为轻度神经元损伤 （10%～25%）；1.5级为轻到中度神经元损伤（26%～45%）；2.0级为中度神经元损伤（46%～54%）；2.5级为中到重度神经元损伤（55%～75%）；3.0级为严重神经元损伤（＞75%）。所得数据进行组间比较，采用SNK-q检验。
1．4DNA提取和电泳腹腔内注射了盐酸脱氧麻黄碱（25 mg/kg）或盐水的鼠脾被分别用作DNA电泳带的阳性和阴性对照。将动物处死后，迅速在冰上将双侧杏仁核区脑组织进行解剖、切碎，参照卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》［６］所描述的方法提取DNA，并放在2%的含有0.5%溴乙锭（EB）的电场中电泳，场强为4 V/cm凝胶（30 V,6 h）。之后，在紫外线下观察、照相，检测有无核内DNA裂解 （DNA梯状电泳带）。
2结果
2．1大鼠点燃后的表现及分级按照Racine［７］方法，根据动物点燃过程中痫性发作的表现将点燃分为5级。A组17只鼠达到5级，3只达到4级；点燃率为100%,共有4只死亡(4/20,20%)，出现痫性发作的时间平均为用药后15 min，脑电图上有痫样放电的表现。B组鼠无痫性发作者，无死亡者，脑电图无痫样放电的表现。
2．2大鼠杏仁核神经元损伤的分级在光镜下，嗜酸性神经元表现为细胞皱缩，有固缩但仍完整的细胞核，HE染色中胞浆红染。在A组大鼠，两个时点上均出现了嗜酸性神经元。该组大鼠第24小时神经元损伤分级平均为1.0，第48小时神经损伤分级平均为1.5。在B组大鼠于两个时点均未发现嗜酸性神经元，神经损伤分级均为0级。两组比较，均有显著性差异（P<0.01）。
2．3大鼠杏仁核神经元损伤的电镜下表现我们观察到，A组大鼠在第24小时和第48小时两个时点仅发现坏死和趋向于坏死的神经元，未发现典型凋亡细胞。电镜下表现为细胞变暗、皱缩，胞浆空泡变性，核固缩以及小的散在的染色质凝聚。B组大鼠未出现坏死或凋亡的神经元。
2．4大鼠杏仁核区脑组织DNA电泳结果A组大鼠于第24小时和第48小时两个时点均出现DNA梯状电泳带，后者的条带更为清晰。B组大鼠未出现DNA梯状电泳带。
讨论
近年来对癫痫发作后神经元损伤的研究日渐增多。凋亡和坏死是神经元死亡的两种不同的形式，最初是以形态学的标准来区别的［８］。传统观点认为，凋亡是一个程序性的细胞死亡（programmed cell death,PCD）过程，近年来国内外大多文献将凋亡和程序性细胞死亡的概念等同。在凋亡过程中，细胞表面受体激活立早基因（immediate early genes,IEG）以及死亡信号蛋白，此二者再激活caspase蛋白水解酶系统［９］，导致染色体DNA的阶段性降解，故凋亡细胞出现DNA梯带电泳及TUNEL染色阳性；近年来国内外大多学者亦将这两项指标作为诊断细胞凋亡的特异性生化指标。相对而言，坏死通常被认为是指细胞受到激烈的物理、化学刺激或严重的病理性刺激后，大量离子内流导致的细胞被动裂解。既往研究认为，癫痫发作后，在谷氨酸持久释放，突触后兴奋作用持久加强的情况下，神经元膜持续去极化，Na+通过AMPA和KA受体门控的离子通道大量内流，Cl-在静电势能的驱动下进入细胞，于是水大量内流，造成神经元急性肿胀，细胞器破坏，染色质遂即降解，最后细胞膜破坏，内容物释放，引起炎症反应。整个过程为一个被动过程，无基因调控，不需要能量。由于不存在染色质的阶段性降解，故坏死神经元不出现DNA梯带电泳和TUNEL染色阳性。我们用锂-匹鲁卡品诱发大鼠癫痫持续状态后，分别于两个时点（第24小时和第48小时）镜下观察杏仁核神经元的损伤形态，结果仅发现坏死和正趋向坏死的神经元，未发现典型的凋亡细胞。在相同部位取脑组织做电泳，有梯带样表现。国外学者Fujikawa［３］等通过实验得出了相似结果。作者用海仁藻酸诱发癫痫持续状态3 h后，分别于第24、48和72小时三个时点，从多个部位取材做脑切片在电镜下观察，并在相同脑区取脑组织进行DNA 电泳和TUNEL染色，结果发现，癫痫持续状态后，神经元的损伤在电镜下表现为坏死，未见典型凋亡。在相应脑区所取的脑组织出现了DNA梯状电泳带和TUNEL染色阳性。我们用锂-匹鲁卡品做致痫剂，所得结果与Fujikawa 等研究结果基本一致。分析其原因，我们认为有二：①癫痫发作后确实存在神经元损伤的凋亡机制，国内外众多学者亦证实了这一点［10］。但凋亡是一个动态的过程，一旦形成凋亡小体，即立即被吞噬细胞清除，故这种瞬间、局限的取材很难看到典型的凋亡小体，因而不能确定凋亡的存在。②有众多文献报道，坏死是成年鼠脑缺血、缺氧以及痫性发作导致的神经元死亡的主要形式［３，４，１１］，而有关神经元坏死的机制知之甚少。癫痫发作后，形态上表现为坏死的神经元出现了DNA梯状电泳带和TUNEL染色阳性，提示在神经元坏死的过程中存在DNA的阶段性降解。Rink等［１２］在实验性鼠脑外伤所致神经元死亡的研究中发现，形态学上表现为坏死的神经元也存在DNA断裂。由此我们猜测，坏死和凋亡仅仅是细胞死亡的两种形态学上的表现，其过程中均涉及程序性细胞死亡机制的激活，其具体机制尚待进一步研究探讨。（第一作者梁决寅为山东省省立医院神经科在读研究生）
参考文献
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5． 李伯勤，张圣明．医学超微结构基础［Ｍ］．济南：山东科学技术出版社，2003．270～２９０
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12． Rink A, Fung KM, Trojanowski JQ, et al. Mclntosh TK:evidence of apoptic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat［J］. Am J Pathol,1995, 147:1575
1 山东省省立医院神经科济南市 250021；
2 滨州医学院附属医院神经科；
3 滨州医学院附属医院脑电图室