微量注射甲基软海绵酸对大鼠海马神经元放电的影响

    【摘要】 目的探寻新的建立老年痴呆模型的方法。方法大鼠海马背侧微量注射0.4 mmol/L 甲基软海绵酸（Okadaic acid,OA)1 μ1，每两天 1 次，连续 3 次。海马背侧首次微量注射20 d后，测试各组大鼠空间学习记忆能力；行为学检测结束后，在注射对侧海马观察各组神经元自发放电。结果海马背侧微量注射OA大鼠空间学习记忆能力明显降低，海马神经元放电频率明显减少，放电形式发生改变。结论OA对海马影响明显，提示此法可建立老年痴呆模型。

    【关键词】Alzheimer病；甲基软海绵酸；自发放电；Morris水迷宫；动物模型

    The effect of the discharge of hippocampus neurons of rats by injection of okadaic acid

    LI QingchunZENG ZhaoyiJIANG Naichanget al

    Department of Physiology,Binzhou Medical College,Binzhou256603

    【Abstract】Objective In order to explore a new way of establishing Alzheimer's animal model. MethodsOkadiac acid(0.4mmol/L1 μl) was injected into the right dorsal hippocampus,once every two days for three times.The place navigation and spatial probe ability in rats were assessed by Morris water maze on day 20 after the first injection.After the spatial probe test,the  spontaneous discharge was observed in the left hippocampus.  ResultsBy injecting okadaic acid into the dorsal hippocampus,the spatial learning and memory ability in rats was significantly impaired by okadaic acid,the discharge frequency of hippocampus neurons was signifcianly reduced,and the format of the discharge was also changed.ConclusionOkadaic acid affected the hippocampus significantly.It suggests that this method can be used to establish the experimental model of AD.

    【Key words】Alzheimer's disease,okadaic acid, spontaneous discharge, Morris water maze,animal model

    Alzheimer病（AD）是常见的老年慢性退行性神经疾病，到目前为止，其确切病因和发病机制尚不清楚。临床上首先表现为近期记忆力降低，继而表现为持续性智能衰退，失语，判断推理能力丧失，以及运动功能障碍等。目前用于AD研究的模型较多，但均不理想。有文献报道，大鼠侧脑室微渗透泵慢性注射甲基软海绵酸（大田酸；Okadaic acid，OA）后，出现学习记忆障碍，在海马CA1区和齿状回见到双螺旋细丝（paired helical filament,PHF）和淀粉样蛋白前体（APP）阳性营养不良性轴突等改变，并伴有细胞凋亡现象，认为OA毒性动物可能是一种较理想的AD模型［１，２］。本文通过大鼠海马背侧埋管多次微量注射OA，观察大鼠条件反射及海马神经元自发放电，旨在探讨大鼠海马微量注射OA后的变化，以期能够找到一种理想的老年痴呆模型。

    1材料和方法

    1.1试剂和仪器OA粉剂（购自Sigma公司），临用前溶解于10%二甲亚砜（DMSO）中，制成浓度为0.4mmol/L的溶液；DigBehv Morris水迷宫（上海计量软件科技有限公司）；脑立体定位仪、DYT-   1型微电机操纵器（天津医疗器械研究所）；微机、BL-   420E生物机能系统（成都泰盟科技有限公司）。

    1.2动物及分组Wistar大鼠20只，雄性，3~5月龄，体重250~300 g，购自贵阳医学院动物中心［合格证号：SCXK(黔)2002-   0001］。随机分为2组：海马注射OA模型组和对照组，每组10只大鼠，自由进食、饮水，自然昼夜节律光照。

    1.3模型制作注射OA组大鼠选择右侧海马为注射靶区，经10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔麻醉后，固定大鼠于立体定位仪上，常规备皮，切开皮肤。参照大鼠脑立体定位图谱［３］，经预实验确定进针点为：A 3.6 mm，R 2.4 mm，H 2.7 mm处。用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，针头刺破硬脑膜。将十字套管上端连于定位针，插到海马上部，502胶水涂于十字套管周围，牙托水和牙托粉混合成糊状涂于十字套管周围，干燥后，抽出定位针。用1 μl微量注射器抽取1 μl OA溶液,通过十字套管缓慢注入海马，1 min内注完，留针10 min，以使药品充分扩散。对照组用同样的方法注射等容积的10%二甲亚砜。以后每隔两天注射 1 次，连续注射 3 次。每只大鼠每天肌肉注射青霉素预防感染，连续5 d。水迷宫测试于首次注射后第20天开始，海马神经元自发放电于首次注射后第27天开始。

    1.4行为学观察Morris水迷宫由圆形水池及自动录像、记录系统两部分组成。水池直径160 cm，水池深50 cm，水深30 cm，水温(25±1)℃，水池内充放洁净自来水，水中加适量黑色素，以隐蔽站台。实验时将水池划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限，见图1。在水迷宫水池壁各象限中点处标明4个入水点，在第Ⅲ象限中放置一个直径12 cm的站台，没于水下1 cm，以站台中心6 cm的区域为E区。实验时将大鼠面向池壁，分别从四个象限的入水点放入水池，自动录像系统记录大鼠找到平台的时间和游泳路径。实验共7天，即 6 d进行定向航行实验（place navigation test）：将大鼠从入水点放入水池中，记录60 s内大鼠从入水到爬上平台所需时间即逃避潜伏期。每只大鼠每天训练4次，即从四个象限不同入水点入水进行训练各 1 次。于第7天进行

    图1Morris水迷宫训练示意图

    1.5海马神经元单位放电术后第27天，大鼠经腹腔注射20%乌拉坦（1 g/kg）麻醉后，固定在立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱［3］，在A 4.0~5.0 mm，L 5.0~5.2 mm，H 2.7~7 mm，用DYT-   1型微电机操纵器，将玻璃微电极插入左侧海马内，引导海马CA1、CA3区神经元自发放电。微电极内充灌0.5 mol/L醋酸钠和2%滂胺天蓝溶液，电极尖端直径1~2 μm,直流电阻为2~15 MΩ。微电极引导信号经放大器放大，监听器监听,电脑BL-   420生物机能系统记录并分析，进行数据处理。实验结束电泳滂胺天蓝，通电10~15 min以标记记录部位，然后经主动脉灌注，取脑，置于10%福尔马林溶液中固定，1 周后，作连续冰冻切片，进行组织学鉴定，以确定记录部位，定位不准确的结果舍去。

    1.6统计学处理实验数据以x ±s表示,采用t检验和χ2检验。

    2结果

    2.1OA对大鼠空间学习记忆的影响大鼠海马背侧首次微量注射20 d后，用Morris水迷宫法检测两组大鼠的定向航行、空间探索能力。定向航行试验结果见表1。在6 d的训练中，两组的逃避潜伏期均不断缩短，但对照组第 6 天比第 1 天缩短了79.68%，而模型组比第 1 天仅缩短了60.25%,两者相比，差异性显著（P<0.05）；且从第 3 天开始，大鼠逃避潜伏期对照组和模型组相比差异性显著（P<0.05）。

    表1对照组和模型组大鼠空间定向航行能力分组[]n[]逃避潜伏期（略）注：与对照组相比，▲P＜0.    05。

    大鼠空间探索实验结果见表2。在6 d训练结束后，于第7天撤去站台，以大鼠穿越站台次数及大鼠在第Ⅲ象限游泳距离占总游泳距离百分比作为衡量记忆好坏指标，模型组穿越站台次数比对照组少50.    45%，两组比较差异性显著（P<0.    05）；模型组大鼠在第Ⅲ象限游泳距离占总游泳距离百分比比正常对照组少22.01%，两组比较有显著性差异（P<0.    05）。大鼠游泳方式典型轨迹见图2，大鼠空间搜索过程的游泳轨迹在正常对照组多以第Ⅲ象限为主，即绕站台游泳（图2B）占30%，穿梭样寻找（图2C）占45%，作环池游泳（图2A）占25%；而模型组在第Ⅲ象限绕站台游泳仅为总距离的20%，穿梭样寻找占25%，而以环池游泳为主要方式者占55%。经χ2检验显示各种搜寻方式的构成比在两组中有明显差异（P<0.    01）。

    表2对照组和模型组大鼠空间探索能力分组[]n[]穿越站台次数（略）注：与对照组相比，▲P＜0.    05

    2.2OA对大鼠海马神经元单位放电的影响本次实验共记录到141个海马神经元自发放电，正常对照组76个，模型组 65 个。采用每分钟记录到的细胞放电数（即频率）作统计学处理，两组比较有显著性差异（P<0.    05）,见表3。根据放电间隔时间不同，海马神经元自发放电可分为规则型（放电间隔时间基本相等）和不规则型两大类。每一型又分为单放（单个放电）亚型和单放+簇放（簇状放电）亚型，见图3。从表3可以看出，模型组海马神经元放电频率比对照组明显减少，两组相比差异性显著（P<0.    05）；对照组规则型放电占20.05%，模型组仅9.    23%，而模型组不规则型放电占90.    84%，对照组占78.    95%，说明放电形式也发生了变化。 A大鼠环池游泳B大鼠绕站台游泳C大鼠穿梭游泳

    图2大鼠典型游泳轨迹图

    表3对照组和模型组海马神经元自发放电分组[]放电神经元（略）注：与对照组相比，▲P＜0.    05。

    图3大鼠海马神经元不规则放电

    3讨论

    目前AD所引起的老年健康问题已受到全世界广泛关注，有关其病理、病因学研究已成为热点。AD患者的主要神经系统病理改变为：神经细胞之间形成大量老年斑（senile  plaques,SP）和神经细胞内出现神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。老年斑的主要成分是由APP裂解成的β-   淀粉样蛋白（β-   amyloid peptide,Aβ）；神经纤维缠结由许多互相缠绕的细丝形成的成对螺旋状结构组成，其主要成分是过度磷酸化tau蛋白。这些病理改变主要发生在海马和新皮层［４］。海马与机体的学习、记忆密切相关，海马不同区域的功能不尽相同，其中CA1和CA3区在学习、记忆中担负重要作用［５~７］。目前用于AD研究的动物模型有衰老动物模型、损毁模型、自身免疫性痴呆模型、转基因动物模型等，但都缺乏AD脑内特征性病理变化［８］。在AD患者脑中，异常过度磷酸化tau蛋白含量显著增高，它聚集成双螺旋丝形状，丧失了促进微管组装的生物活性，导致细胞骨架的结构异常和神经细胞死亡［９，１０］。OA是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A的活性。正常胞内磷酸酯酶和磷酸激酶处在动态平衡之中，OA通过抑制磷酸酯酶使激酶处于相对高活性状态，从而能使tau蛋白高度磷酸化并形成NFTs样改变，还可使海马神经元细胞发生凋亡［１１~１３］。本实验采用海马背侧多次微量注射OA建立拟AD模型。通过水迷宫实验测试，发现模型组大鼠逃避潜伏期与正常对照组大鼠比较差异显著（P<0.05），说明模型组大鼠空间方位记忆能力明显降低。在撤去平台后，模型组大鼠穿越站台次数及在第Ⅲ象限游泳距离占总游泳距离百分比较正常对照组明显减少，各种空间搜寻方式的构成比在两组有明显差异，表明模型组大鼠学习行为模式也发生了改变。脑电活动是直接反应大脑细胞功能状态的较好指标，只要神经细胞的功能稍有改变，其电活动即随之改变。我们通过观察海马CA1、 CA3区神经元自发放电发现，模型组海马放电频率远远较正常组低,两组比较差异显著（P<0.05），且放电形式也发生了改变。结合近期的报道，海马注射OA可使海马组织出现SP、NFTs等AD样特征性病理变化［１４］。我们认为海马背侧埋管多次微量注射OA建立AD模型，是研究AD病因、发病机制的一种较理想模型，也可以为研究抗AD药物疗效提供载体。

    参考文献

    1.Arendt T.Holzer M,Fruth R,et al.Paired helical filament-   like phosphorylation of tau,deposition of β/A4-   amyloid and memory impairment in rat induced by chronic inhibition of phosphatase 1 and 2A［Ｊ］.Neuroscience,1995,69(3):691.

    2.Arendt T,Holzer M,Fryth R,et al.Phosphoryaltion of tau,Aβ-   formation,and apoptosis after in vivo inhibition of PP-   1 and PP-   2A［Ｊ］.Neurobiol Aging.1998,19(1):3

    3.George P,Charles W.The Rar Brain in Stereotaxic Coordinates［Ｍ］.Second Edition.Orlando Florida:ACADEMIC PRESS INC,1986.26～42.

    4.周慧芳,薛冰,王晓民.Alzheimer病研究进展——β淀粉样蛋白学说与主要防治策略［Ｊ］.自然科学进展,2003,13(2):121

    5.姚志斌.海马——研究神经科学的理想模型［Ｊ］.广东解剖学通报，1989,11(1):17

    6.洪岸.老年学习记忆损害大鼠海马和新皮质小白蛋白神经元的丢失［Ｊ］.中国老年学杂志，2000,20(2):91

    7.Thompson RF,Kim JJ.Memory systerm in the brain and localization of a memory［Ｊ］.Proc Natl Acad Sci USA，1996,93:13438

    8.魏小龙,张永祥.老年性痴呆动物模型研究进展［Ｊ］.中国药理学通报,2000,16(4):372

    9.Jenkins SM,Zinnerman M,Garner C,et al.Modulation of tau phosphorylation and intracellular localization by cellular stress［Ｊ］.Biochem J,2000,345:264
   
    10.Ahlijiania MK,Barrezueta NX,Williams RD,et al.Hyperphosphorylated tau and neurofilament and cytoskeletal disruptions in mice overexpressing human p25,an activator of cdk5［Ｊ］.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:2910

    11.Kim DH,Su J,Cotman CW.Sequence of neurodegeneration and accumulation of phosphorylated tau in cultured neurons after okadaic acid treatment［Ｊ］.Brain Res,1999,839:253

    12.Kim,Hong HN,Lee JH,et al.Okadiac acid induced cycloheximide and caspase sensitive apoptosis in immature neurons［Ｊ］.Mol Cells,2000,10(1):83

    13.魏建设,张玲妹,黄娅琳，等.冈田酸诱导大鼠脑tau蛋白磷酸化和神经细胞退化［Ｊ］.中国神经科学杂志，2002,18(3):577

    14.张章,俞昌喜.一种简易的实验性阿尔茨海默病大鼠模型［Ｊ］.福建医科大学学报，2002,36(4):459

    滨州医学院生理学教研室滨州市256603；2 贵阳医学院生理学教研室